[发明专利]农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法

权利要求书

1.农杆菌介导的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝液制备：培养小麦光腥黑粉菌冬孢子，当冬孢子萌发率≥60％时收集菌丝，离心去上清液，然后用灭菌水配制浓度为1×10⁶个/ml的菌丝液；

(2)农杆菌菌液制备：将含有表达载体的根癌农杆菌菌株EHA105接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养2-3d，用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.5，继续振荡培养7-8h，然后用IM培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.45-0.5；所述IM培养基在使用之前，每毫升IM培养基加入4μL0.2mol/L乙酰丁香酮，1μL 0.01％FeSO₄(w/v)，10μL 100mg/mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸，将OD₆₀₀为0.45-0.5的农杆菌菌液与1×10⁶个/ml的菌丝液等体积混合并加入乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/l，然后涂布于玻璃纸上，置于22℃下黑暗培养24h；然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上，使涂布有菌液的一面贴合培养基，16℃培养至菌落长出。

2.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，培养小麦光腥黑粉菌冬孢子的步骤如下：配制浓度为(100-105)×10⁴个/mL的冬孢子悬浮液，取冬孢子悬浮液涂布于水琼脂培养基上，置于16℃，相对湿度为80％的人工气候生长培养箱中全光照培养。

3.根据权利要求2所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述水琼脂培养基的配方为：称取20g琼脂粉，加水定容到1L。

4.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基的配方为：酵母膏1g，酶水解干酪素0.5g，酸水解干酪素0.5g，葡萄糖10g，Ca(NO₃)₂·4H₂O 1g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，NaCl 0.15g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL。

5.根据权利要求1所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述IM培养基的配方为：K-buffer 0.8mL，M-N buffer 20mL，1％CaCl₂·2H₂O(w/v)1mL，20％葡萄糖(w/v)10mL，20％NH₄NO₃(w/v)2.5mL，50％甘油(v/v)10mL，补蒸馏水至1000mL；

所述K-buffer的配方为：200g/L K₂HPO₄，145g/L KH₂PO₄；

所述M-N buffer的配方为：30g/L MgSO₄·7H₂O，15g/L NaCl。

6.根据权利要求1-5任一所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述表达载体为pDHT-sk。

7.根据权利要求6所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。

8.根据权利要求6所述的小麦光腥黑粉菌转化方法，其特征在于，所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。