[发明专利]番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法。本发明通过研究检测番茄红素对高糖下小鼠足细胞的影响，得出番茄红素对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用及机制。本发明提供的一种番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，包括小鼠永生系肾足细胞的培养步骤、MTT法检测细胞增殖活性的步骤、Western Blot检测蛋白表达水平的步骤以及活性氧的检测的步骤。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法。

背景技术

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病较为常见的严重并发症，也是临床上终末期肾脏疾病发生的重要原因之一。早期DN临床表现为患者出现微量蛋白尿，随后进展为蛋白尿恶化，肾小球滤过率降低等变化，导致肾功能缺失。足细胞作为蛋白滤过的最后屏障，其细胞损伤导致的功能异常也成为蛋白尿产生的原因之一，是DN的致病因素之一。高血糖是引起糖尿病肾损伤的主要因素，能够产生氧化应激，增加晚期糖基化终产物和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，加重肾损伤。

番茄红素(Lycopene，Lyc)是西红柿等植物富含的天然色素，具有较强的抗氧化和抗自由基作用，还具有抗炎、抗肿瘤等作用。有研究显示，Lyc能够改善糖尿病大鼠的糖尿病肾病进展。尽管如此，Lyc在糖尿病肾病中的保护作用及其机制研究较少。

发明内容

本发明通过研究检测番茄红素对高糖下小鼠足细胞的影响，得出番茄红素对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用及机制，提供一种番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法。

本发明提供的番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，包括以下步骤：

MPC5细胞的培养步骤：复苏细胞后进行增殖培养，待细胞融合度达80％～90％时进行细胞传代，之后进行分化培养10～14天，再之后进行同步化处理；

MTT法检测细胞增殖活性的步骤：选取经过MPC5细胞的培养步骤之后的细胞，接种到培养板中培养过夜，之后分组进行细胞干预处理，分组分别为

正常糖组：补充5～6mmol·L-1葡萄糖；

高渗组：补充5～6mmol·L-1葡萄糖和19～20mmol·L-1甘露醇；

高糖组：补充20～30mmol·L-1葡萄糖；

高糖组+低剂量Lyc：补充20～30mmol·L-1葡萄糖+3～3.25μmol·L-1Lyc；

高糖组+中剂量Lyc：补充20～30mmol·L-1葡萄糖+6～6.5μmol·L-1Lyc；

高糖组+高剂量Lyc：补充20～30mmol·L-1葡萄糖+12～13μmol·L-1Lyc；

干预处理结束后，加入MTT溶液混匀后继续细胞培养，之后离心去上清，加入DMSO震荡混匀后测定吸光度OD值；

Western Blot检测蛋白表达水平的步骤：各组细胞经葡萄糖和/或甘露醇以及Lyc进行干预处理，高糖和Lyc处理的同时，加入LY294002，之后收集细胞沉淀，提取细胞总蛋白对总蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜至PVDF膜上，之后采用脱脂牛奶室温封闭，TBST洗膜后采用一抗稀释液孵育过夜，TBST洗膜后继续使用二抗稀释液室温孵育，TBST洗膜后使用化学发光试剂显色，之后用化学发光分析仪检测；

活性氧的检测的步骤：细胞经上述分组干预处理结束后更换为含有ROS探针工作液的无血清培养基，避光孵育，之后收集细胞培养液及清洗液以及单细胞悬液，离心后去掉上清，加入适量PBS重悬细胞，之后采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。