[发明专利]番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法

权利要求书

1.番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

MPC5细胞的培养步骤：复苏细胞后进行增殖培养，待细胞融合度达80％～90％时进行细胞传代，之后进行分化培养10～14天，再之后进行同步化处理；

MTT法检测细胞增殖活性的步骤：选取经过MPC5细胞的培养步骤之后的细胞，接种到培养板中培养过夜，之后分组进行细胞干预处理，分组分别为

正常糖组：补充5～6mmol·L^-1葡萄糖；

高渗组：补充5～6mmol·L^-1葡萄糖和19～20mmol·L^-1甘露醇；

高糖组：补充20～30mmol·L^-1葡萄糖；

高糖组+低剂量Lyc：补充20～30mmol·L^-1葡萄糖+3～3.25μmol·L^-1Lyc；

高糖组+中剂量Lyc：补充20～30mmol·L^-1葡萄糖+6～6.5μmol·L^-1Lyc；

高糖组+高剂量Lyc：补充20～30mmol·L^-1葡萄糖+12～13μmol·L^-1Lyc；

干预处理结束后，加入MTT溶液混匀后继续细胞培养，之后离心去上清，加入DMSO震荡混匀后测定吸光度OD值；

Western Blot检测蛋白表达水平的步骤：各组细胞经葡萄糖和/或甘露醇以及Lyc进行干预处理，高糖和Lyc处理的同时，加入LY294002，之后收集细胞沉淀，提取细胞总蛋白对总蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜至PVDF膜上，之后采用脱脂牛奶室温封闭，TBST洗膜后采用一抗稀释液孵育过夜，TBST洗膜后继续使用二抗稀释液室温孵育，TBST洗膜后使用化学发光试剂显色，之后用化学发光分析仪检测；

活性氧的检测的步骤：细胞经上述分组干预处理结束后更换为含有ROS探针工作液的无血清培养基，避光孵育，之后收集细胞培养液及清洗液以及单细胞悬液，离心后去掉上清，加入适量PBS重悬细胞，之后采用流式细胞仪检测细胞内荧光强度。

2.根据权利要求1所述番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，其特征在于，MPC5细胞的培养步骤中，复苏细胞采用含10％FBS和IFN-γ的RPMI-1640培养基。

3.根据权利要求1所述番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，其特征在于，MTT法检测细胞增殖活性的步骤中，吸光度OD值在540nm波长处测定。

4.根据权利要求1所述番茄红素在制备治疗糖尿病肾病产品中应用的研究方法，其特征在于，活性氧的检测的步骤中，采用800×g离心5min后去掉上清。