[发明专利]一种炎症标志物联合定量检测试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种炎症标志物联合定量检测试纸制备方法，包括炎症标志物抗体标记与制备检测试纸，所述炎症标志物抗体标记步骤如下：

①用羧基化聚苯乙烯微球包裹Eu³⁺-Fe₃O₄复合物制备的磁性稀土荧光微球，粒径200nm，固含量为1％；

②取磁性稀土荧光微球1mL，加入5mL pH 7.0、0.02M 3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液，混匀，25000rpm离心10min，弃上清；再加入5mL MOPS，90W超声，工作2s，间歇5s，重复2次，25000rpm离心10min，弃上清；

③再次加入5mL MOPS，90W超声，工作2s，间歇5s，重复2次，完成对微球的清洗；

④在清洗后微球中加入15mg EDC和50mg sulfo-NHS，涡旋混匀后，37℃反应15min；

⑤反应完成后，加入2-巯基乙醇8.6μl，终止羧基的活化；

⑥分别加入血清淀粉样蛋白A、超敏C反应蛋白、降钙素原对应抗体各1mg，置于旋转培养箱上，37℃反应90～120min；

⑦然后加入100μL 5％BSA和100μL 1％PEG20000，对未标记的位点进行封闭，置于旋转培养箱上，37℃反应60min；

⑧反应结束后，将上述液体2000rpm离心15min，弃上清，加入含1％BSA、10％蔗糖、2％海藻糖的pH8.0 0.2M硼酸硼砂缓冲液的保存液5mL，超声2s；

⑨将标记后的微球稀释50～100倍，每支200μL分装，即为单人份半成品；

所述炎症标志物联合定量检测试纸制备步骤：

①用BIODOT三维喷金点膜仪，以1μl/cm参数，在硝酸纤维素膜上包被血清淀粉样蛋白A、超敏C反应蛋白、降钙素原相应的抗体三条检测线，和一条羊抗鼠/羊抗兔IgG质控线，37℃干燥16小时，作为反应膜；

②用含0.5％Tween-20的0.1M PBS溶液浸泡玻璃纤维，然后37℃干燥16小时，裁剪17mm×300mm为作为样品垫；

③将样品垫、反应膜和22mm×300mm的吸水纸以层层叠压的形式黏贴组装在底板上；

所述炎症标志物抗体标记步骤①中羧基化聚苯乙烯微球的制备如下：

1.1聚苯乙烯微球种子的制备

1.1.1量取100ml的苯乙烯于分液漏斗中，用1M NaOH洗涤3次，除去苯乙烯中的杂质，然后用纯化水洗涤至中性，然后置入干燥皿中干燥24h以上；

1.1.2将氩气充入反应装置中，除去装置中的氧气；

1.1.3在反应装置中加入100ml的乙醇，然后加入5g PVP，搅拌30min；

1.1.4加入40ml已洗涤过的苯乙烯和5ml偶氮二异丁腈，水浴升温至45℃，反应30min，然后将反应温度升高至75℃，反应12h；

1.1.5反应结束后，用网筛过滤上述反应液，然后用无水乙醇洗涤离心3～5次，然后将初步除杂后的聚合物在40％乙醇中，使其自然沉淀，称取沉淀重量；

1.2聚苯乙烯表面的羧基化修饰

1.2.1将上述分散所得的聚苯乙烯微球作为种子1g，用10ml 0.25％SDS将其分散；

1.2.2然后在上述体系中加入2倍种子重量的环己烷，35℃溶胀16～18h；

1.2.3称取0.02g过氧化苯甲酰、量取10μl乙二醇独甲醚和10μl二甲基苯烯酸乙二醇酯，分别加入至上述反应液中，继续溶胀12h；

1.2.4溶胀结束后，加入2.5mg PVA，提高反应温度至75℃，继续反应10～12h；

1.2.5用乙醇反复洗涤3次，除去未反应的单体和低聚物，然后20000rpm离心沉降微球；

所述炎症标志物抗体标记步骤①中羧基化聚苯乙烯微球包裹Eu³⁺-Fe₃O₄复合物制备磁性稀土荧光微球的步骤如下：

1.3.1将FeCl₂、FeCl₃、EuCl₃、NaOH溶液，按摩尔比例Fe²⁺：Fe³⁺：Eu³⁺：Na⁺＝1:1:2:5，将其溶液进行混合，搅拌反应，得到沉淀，陈化3～5h后过滤，用纯化水洗涤2～3次，干燥、研磨后获得Eu³⁺-Fe₃O₄复合物。

1.3.2取0.1g羧基化修饰的聚苯乙烯微球，加入至20ml异丙醇中，超声分散10min；

1.3.3称取Eu³⁺-Fe³O⁴复合物0.5mg，加入至5ml氯仿中，超声分散20min；

1.3.4将1.3.2和1.3.3中的两种液体混合，真空环境中控放置5～6h，然后再置于常压2～3h；

1.3.5将溶胀后的微球用乙醇洗涤3次，用磁场除去未能成功包裹磁微粒的微球。