[发明专利]一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束及载药胶束的制备方法

权利要求书

1.一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束，其特征是：包括亲水端、连接链、疏水端，将所述亲水端、连接链、疏水端合成了锁核酸纳米载药胶束单体，其中所述亲水端是由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC、修饰有氨基的锁核酸BC和修饰有羧基荧光素的反义锁核酸antisense MIC三条链组成，所述连接链是由3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和癸硫醇连接形成有机长链，所述疏水端是紫杉醇，其中，锁核酸MIC、锁核酸BC 、反义锁核酸antisense MIC的核酸序列如下表：

Antisense MIC	TTT TCT CCC AGC GTG CGC CAT-FAM
MIC	1-ATGGCGCACGCTGGGAGAAAA-(CH2)7-NH2]]>
BC	2-(CH2)6-ATGCGCCGCGCTCGCAGATTT-(CH2)7-NH2]]>

。

2.根据权利要求1所述的一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束，其特征是：修饰有羧基荧光素的所述反义锁核酸antisense MIC与所述锁核酸MIC的碱基键互补配对。

3.根据权利要求1所述的一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束，其特征是：所述连接链可平衡所述亲水端的长度。

4.一种基于穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束的制备方法，其特征是：

（一）、胶束单体疏水头基与连接链结构的构建

1）、制备纳米金粒子：纳米金粒子的制备所用容器经王水浸泡24 h以上，保证干净，制备方法：量取浓度为0.01％的氯金酸，用0.45 μm滤膜过滤氯金酸；然后，将50 mL氯金酸加入三口烧瓶中，进行搅拌且加热回流，当溶液沸腾时，迅速加入3 mL柠檬酸钠；保持加热至溶液由黑色到深紫色，再到紫红色，最终变为酒红色；此时，停止加热，冷凝回流至室温，纳米金粒子放置于4℃下，备用；

2）、制备磁珠连接纳米金颗粒：将巯基修饰的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后，取100 μL清洗好的磁珠加入5 mL纳米金粒子，置于37℃的摇床中，反应24 h，将制备完成的纳米金粒子功能化的磁珠用二甲基亚砜清洗三次后，再分散于二甲基亚砜中，备用，

3）、制备纳米金粒子功能化的磁珠连接癸硫醇：将0.48 mmol的癸硫醇加入到已清洗的纳米金粒子功能化的磁珠，将混合液置于37℃的摇床中，反应12 h，将制备完成的磁珠-纳米金粒子-癸硫醇（产物2）用二氯甲烷清洗三次后，分散于二氯甲烷中，备用，

4）、制备产物3：将产物2和0.223 mmol的三乙胺混合，溶于5 mL二氯甲烷，将0.074mmol三光气溶液缓慢的加入混合液中，匀速搅拌，温度保持4℃，反应30 min，取出产物3用二氯甲烷清洗三次后，再分散于二氯甲烷中，备用，

5）、制备产物4：将0.82 mmol三乙胺和一定量的4-氨基吡啶加入到0.0586 mmol紫杉醇和产物3的混合液中，匀速搅拌且温度保持25℃，反应2 h，取出产物4用二氯甲烷清洗三次后，再分散于二氯甲烷中，备用，

6）、制备产物5：将0.2 g碘化钠溶于1mL二甲基亚砜中，将200 μL碘化钠加入到产物4，置于37℃的摇床中，反应4 h，通过磁性分离，得到上清液，即产物5，

（二）、胶束单体亲水头基与连接链结构的构建

1）、制备锁核酸连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯：将10 μL，10^-5 M氨基修饰的锁核酸BC链和10 μL，10^-5 M由氨基和猝灭基团修饰的锁核酸MIC链分别加入到100 μL，10^-5 M的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯中，置于37℃的摇床中，反应6 h，

（三）、锁核酸纳米载药胶束合成

1）、制备锁核酸纳米载药胶束单体：将50 μL锁核酸MIC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物和50 μL锁核酸BC连接3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的产物加入到100 μL产物5中，置于37℃的摇床中，反应6 h，

2）、制备锁核酸纳米载药胶束单体连接修饰荧光基团FAM的锁核酸antisense MIC：向上述混合液中加入10 μL，10^-5 M的修饰荧光基团的锁核酸antisense MIC，置于37℃的摇床中，反应2 h，

（四）、胶束结构表面修饰细胞穿膜肽TAT

1）、制备穿膜肽TAT功能化的锁核酸纳米载药胶束：向锁核酸纳米载药胶束中加入等当量的水，充分摇匀后，加入50 μL，10^-5 M细胞穿膜肽TAT，置于37℃的摇床中，反应2 h，

（五）、药物载体转染组织细胞

1）、将制备好的基于细胞穿膜肽的锁核酸纳米载药胶束置于于离心管中，加入血清浓度为20%的1640细胞培养液1 mL，充分混匀后，加入细胞培养皿中进行细胞培养，置于37℃，5%的二氧化碳培养箱中，培养2 h，

（六）、抗癌药物紫杉醇的释放与检测；

1）、取出培养2 h后的细胞培养皿，去除其中的混合培养液，向培养皿中加入1640培养液，重复冲洗，最后，加入1 mL含有20%血清的培养液,待用，

2）、在激光共聚焦显微镜下观察海拉细胞内FAM的荧光，以488 nm为激发光源，采集550nm与650 nm的发射光，明显观测到：海拉细胞质中有较强的FAM绿色荧光，随着时间的推移，细胞皱缩，至凋亡只需要5 h，表明此载药胶束具有较好的治疗效果。