[发明专利]一种提高植物中植酸酶含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高植物中植酸酶含量的方法，所述方法为：将植酸酶表达框和含抗草甘膦基因的载体连接构建植物表达载体；将植物表达载体电击转化农杆菌宿主，然后转化植物，筛选获得植酸酶含量提高的植物；所述植酸酶表达框是由SEQ ID NO:1所示调控序列、SEQ ID NO:4所示信号肽序列、SEQ ID NO:5所示密码子优化过的appA NR基因序列以及SEQ ID NO:6所示NOS终止子拼接构成；所述调控序列SEQ ID NO:1是由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列拼接构成。本发明产生的转基因大豆植酸酶活性高达1800.5U/g，每千克饲料添加大豆粉0.28‑0.55g就能够满足饲料中植酸酶的需要量。

(一)技术领域

本发明涉及一种提高植物中植酸酶含量的方法。

(二)背景技术

植酸又称肌醇六磷酸，化学名称是环己6醇-1,2,3,4,5,6-六磷酸二氢酯。分子中含有6个磷酸基团，磷的含量高达28.2％。6个磷酸基团强大的络合能力，多与二价的阳离子结合在一起，形成化学性质稳定的络合物，其作用与EDTA相似，但较之有更广泛的适用范围。植酸中所含的磷称为植酸磷，植酸磷占植物总磷量的60-80％(Nelson et al.,1967)，是植物性饲料中磷的主要贮存形式。植酸磷绝大部分不能被单胃动物消化吸收，造成磷的浪费；同时，大量未被消化吸收的植酸磷随动物粪便排出体外，造成环境污染(Ravindranetal.,1995a；Sharpley,1994)。植酸还是一种抗营养因子，它能够与钙、镁、锌、铜、锰、铁、钾等阳离子形成不溶性盐，降低畜禽对矿物质元素的吸收利用率；植酸还可与蛋白质、氨基酸、淀粉等结合，形成不溶复合物，降低动物日粮的营养价值(Prattley and Stanley,1982；Reddy,1989；Sandberg,1991)。

植酸酶是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称，能水解植酸最终释放出能被动物体直接利用的无机磷。它能有效降解饲料中的植酸盐，提高饲料中磷的利用率和各种营养成份的消化率，减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，同时减少环境污染。目前的商品植酸酶一般是通过微生物发酵所得，这不仅需要先进的发酵工艺与设备，还需要多种分离工艺进行植酸酶纯化处理。然后通过一系列包括镶嵌和包被技术在内的后处理工艺进行植酸酶的稳定化处理，使植酸酶在饲料的调制、制粒、膨化等加工工艺及贮存的过程中保持活性稳定。此外，还需构建高效基因工程菌来增加酶的产量从而降低生产成本。

随着DNA重组技术和植物组织培养的快速发展，转基因植物作为一种新型生物反应器备受瞩目。相比微生物发酵，转基因植物生产植酸酶是植物的自然生长过程，易长期储存、长距离运输，生产规模容易放大或缩小，无需进行纯化。北京奥瑞金种业公司的转植酸酶基因玉米成为第一例获得安全证书的转基因玉米，其植酸酶活性最高达120U/g，这与市场上销售的植酸酶(其活性有5000U/g、10000U/g和20000U/g等)仍存在很大差距。典型的植酸酶膳食补充是每千克饲料添加植酸酶500-1000U。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种提高植物中植酸酶含量的方法，所述方法是在大豆种子中生产外源植酸酶。所述方法利用高水平转录的强特异性启动子构建植酸酶转基因表达载体并用于大豆转化，从而获得高效表达植酸酶的转基因大豆，本发明获得重组植酸酶的方法简单，耐储藏方便运输容易规模化低成本生产，可以直接作为饲料添加剂应用于饲料工业。

本发明采用的技术方案是：