[发明专利]厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1--一种新型海洋生物污染检测标记物

权利要求书

1. 厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2. 根据权利要求1所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1，其特征在于：所述p-糖蛋ABCB1编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3. 权利要求1所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1的克隆方法，包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、p-糖蛋ABCB1核心片段PCR扩增、p-糖蛋ABCB1 RACE扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述p-糖蛋ABCB1核心片段PCR扩用引物为：ABCB-real-F1:5’-TGGTGACAAGGGGACACAAC-3’，ABCB-real-R1:5’-CCGCTCTGGCCTTGTCTAAA-3’。

4.根据权利要求3所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法具体包括如下步骤：

1）总RNA提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；

2）cDNA第一链的合成：以步骤1获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；

3）p-糖蛋ABCB1核心片段PCR扩增：根据NCBI数据库中p-糖蛋ABCB1的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而PCR扩增出p-糖蛋ABCB1的核心序列，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收，备用；

4）p-糖蛋ABCB1 RACE扩增全长：基于步骤3获得的ABCB1序列，根据所得的目的序列进行了RACE引物的设计，利用RACE技术扩增得到5’端和3’端序列以及ORF区的验证序列；

5）筛选：将步骤4获得的RACE反应产物连接至PMD18-T载体并转至DH5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液PCR验证后进行序列测定，获得p-糖蛋ABCB1序列；

6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。

5. 根据权利要求3所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1的克隆方法，其特征在于：所述PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH₂O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl₂ 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、10μM Sp-sCAP-F 1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。

6.根据权利要求3所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1的克隆方法，其特征在于：所述PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物。

7.一种利用权利要求1至6任一项所述的厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1用作新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝p-糖蛋ABCB1用作海洋污染的检测标记物。

8.一种利用权利要求7所述的一种新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，其特征在于：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解刨提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测ABCB1在消化腺和腮中的相对表达量，即可。