[发明专利]乙肝病毒核酸的快速扩增方法

说明书

本发明涉及一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法，包括以下步骤：将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，所述核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，所述PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；将所述反应液置于PCR反应管中使所述反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状；将所述PCR反应管置于PCR扩增仪中按照以下反应条件进行PCR扩增：90～100℃预变性10s～600s，90～100℃变性0～1s，50～65℃退火延伸0～1s。本发明在确保扩增的准确性和有效性的前提下，每一个循环所需要的时间都显著地缩短了，实现了快速简单地扩增乙肝病毒核酸的目的。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别是涉及一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，缩写HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。全世界约有2.57亿感染HBV，中国有9300万HBV感染者。因此，对乙型肝炎病毒的研究在世界范围内得到了重视。而在乙型肝炎病毒的相关科学研究中，常常需要对乙肝病毒核酸进行非疾病诊断或治疗目的的扩增，以获得大量的乙肝病毒核酸，从而为各种科学试验提供样品。

聚合酶链式反应(PCR)是一种主要的核酸体外扩增技术，近年来发展迅速。PCR技术的特点是模拟生物体内DNA的复制过程，在合适的温度条件下，利用扩增所需要的模板、引物、聚合酶等原料，使目标DNA或RNA片段经过变性、退火和延伸的不断循环得到目标DNA或者RNA片段的指数倍扩增。PCR作为分子生物学研究的基础技术，促进了生命科学的发展，但由于一般的PCR方法复杂且耗时，限制了技术的进一步发展，不利于快速获得大量的乙肝病毒核酸样品。

发明内容

基于此，有必要提供一种操作简单且耗时较短的乙型肝炎病毒核酸的快速扩增方法。

一种乙肝病毒核酸的快速扩增方法，包括以下步骤：

将含有乙肝病毒的样品与核酸释放剂混合后加入PCR预混液得到反应液，所述核酸释放剂包括莎梵婷、氯化钾、十二烷基磺酸钠和乙醇，所述PCR预混液包括脱氧核糖核苷三磷酸、如SEQ No.1序列所示的上游引物、如SEQ No.2序列所示的下游引物、DNA聚合酶和扩增缓冲液；

将所述反应液置于PCR反应管中使所述反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状；

将所述PCR反应管置于PCR扩增仪中设定以下反应条件进行PCR扩增：预变性温度设为90～100℃，预变性时间设为10s～600s，变性温度设为90～100℃，变性时间设为0～1s，退火延伸温度设为50～65℃，退火延伸时间设为0～1s。

本发明的乙肝病毒核酸的快速扩增方法主要从两方面进行了优化，一方面在核酸的提取上，采用莎梵婷、氯化钾和十二烷基磺酸钠等强烈的蛋白变性剂快速破坏病毒外壳，彻底释放出病毒核酸，有利于PCR的快速扩增，且无需单独进行加热、离心、去上清等提取工作，只需将样品与核酸释放剂及其他PCR必须的组分加入反应管中混匀即可。而且所采用的上下游引物具有十分优异的扩增效率，灵敏度高，特异性强，能够检测出HBV的八个基因型，进一步为PCR的快速扩增奠定了基础。另一方面，通过将反应液置于PCR反应管中使反应液呈厚度小于等于0.1mm的薄膜状，可以显著地提高热传递效率，降低了反应液各部分的温度变化差异，提高了反应液整体的温度一致性和变温速度，为PCR的快速扩增提供了另一关键要素。在结合以上两方面的因素的情况下，本发明进而采用以下时间极短的的反应条件进行PCR扩增：90～100℃预变性10s～600s，90～100℃变性0～1s，50～65℃退火延伸0～1s。如此，在确保扩增的准确性和有效性的前提下，每一个循环所需要的时间都显著地缩短了，且随着循环数的增加，节省的时间和能耗愈加明显，实现了快速简单地扩增乙肝病毒核酸的目的，从而为各种科学研究提供足够多的核酸样品。