[发明专利]基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法

说明书

本发明提供了基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法，目的是为了能有效控制弧菌病的发生与流行、保障海水养殖业的健康发展。针对弧菌共有的dnaJ基因，在dnaJ基因序列两端的保守区域设计一对可扩增几乎全长dnaJ基因的简并引物，而建立的扩增弧菌几乎全长dnaJ基因的PCR方法。该方法具有快速、便捷、灵敏、准确、适应性好等优点，不仅可用于弧菌属细菌的快速检测，结合序列测定分析还可以准确鉴定弧菌的种类，为有效地控制弧菌病的发生与流行奠定了基础。

技术领域

本发明涉及弧菌的快速检测方法，具体涉及基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法。

技术背景

弧菌属(Vibrio spp.)是一群菌体短小、弯曲成弧状或逗点状的革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，以海水中最多，是常见的一种条件致病菌，在水体富营养化的养殖环境下可迅速繁殖，引起养殖动物暴发弧菌病，造成严重危害，此外，弧菌能感染人类造成腹泻、创伤感染、中耳炎等，是一种重要的食源性病原菌。近几年水产病害监测数据显示，弧菌病已成为海水养殖中最为常见、流行广、危害大的一类疾病，致病性弧菌引起卫生健康事件也时有报道。目前，弧菌的检测主要采用传统的生化鉴定，需经增菌、分离纯化、染色、生化鉴定等步骤，操作过程烦琐、检测周期长，不适合大量样本的分析及快速检测的需要。因此，开展弧菌快速检测和种间鉴定技术研究对有效控制弧菌病的发生与流行、保障海水养殖业的健康发展以及重大公共卫生安全具有重要意义。

在细菌分类学上，16S rDNA基因和管家基因序列分析都可以用于细菌种属的分子鉴定，但弧菌存在16S rDNA基因多拷贝现象，导致在弧菌鉴定上应用16S rDNA基因序列分析方法时存在局限性与不确定性。管家基因hsp60、gapA、gyrB、recA、rpoA和pyrH都曾被用于弧菌种类鉴定和系统发育研究，其中hsp60、gapA和gyrB仅能鉴定少数种类；而recA、rpoA和pyrH则被认为是弧菌种类鉴定强有力的分子标记，但利用这些基因还是无法区分neptunius弧菌和溶珊瑚弧菌及鳗弧菌和ordalii弧菌，即不能对所有的弧菌进行鉴定。dnaJ基因长约1150bp，编码热休克蛋白40，在不同细菌种内高度保守，已被证明非常适用于分支杆菌属、军团菌属和链球菌属的种间鉴定，dnaJ基因序列在区分和鉴定弧菌近缘种方面，也比16S rDNA、recA、rpoA和hsp60基因有着更高的分辨率。

现有的研究表明，dnaJ基因可作为弧菌种类鉴定的遗传进化标记，其序列分析已成为鉴定弧菌种类的有力工具。但目前仅报道扩增dnaJ基因558bp片段用于序列分析，对部分弧菌不能准确鉴定；若能建立一种扩增弧菌dnaJ基因几乎全长的PCR方法，必将有助于弧菌的检测及其种类的准确鉴定。

发明内容

基于以上现有技术的不足，本发明提供基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法。选择弧菌dnaJ基因为靶基因，优化引物设计和反应条件，建立一种能扩增几乎全长dnaJ基因的PCR方法，为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供更全面、更准确的技术手段。

本发明的具体技术方案如下：

引物设计

从GenBank中下载已公布的10种常见弧菌的dnaJ基因全序列，采用MegAlign软件中的Clustal W方法进行同源性比较分析，利用Primer Premier 5.0软件筛选结合Oligo6.0软件评价在dnaJ基因序列两端的保守区域设计一对可扩增几乎全长dnaJ基因的简并引物，上游游引物XX-VF1:5'-GTGATTTTTACGAAGTATTAGGC-3'，下游引物XX-VR1:5'-GGTTAAATCRTCRAARAACTT-3'，预期片段大小为1130bp。

基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法，具体包括如下步骤：