[发明专利]基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法在审
| 申请号： | 201810728040.6 | 申请日： | 2018-07-04 |
| 公开（公告）号： | CN109266724A | 公开（公告）日： | 2019-01-25 |
| 发明（设计）人： | 韦信贤;童桂香;黄光华;梁万文;黎建斌;黄国秋;黄鸾玉 | 申请（专利权）人： | 广西壮族自治区水产科学研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/686 | 分类号： | C12Q1/686;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/63 |
| 代理公司： | 浙江永鼎律师事务所 33233 | 代理人： | 郭小丽 |
| 地址： | 530021 广*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 弧菌 鉴定引物 弧菌病 菌种 扩增 海水养殖业 有效地控制 保守区域 简并引物 结合序列 快速检测 有效控制 弧菌属 可用 灵敏 细菌 分析 健康 | ||
1.一种基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法，其特征在于，特异性引物的设计，具体为在dnaJ基因序列两端的保守区域设计一对可扩增几乎全长dnaJ基因的简并引物，上游序列为XX-VF1：5′-GTGATTTTTACGAAGTATTAGGC-3′，下游序列为XX-VR1：5′-GGTTAAATCRTCRAARAACTT-3′，具体包括如下步骤：
S1：标准菌液制备，取纯的弧菌属以及纯的非弧菌属菌株划线于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，条件为36±1℃培养18～24h，取上述菌液1～3mL，以10 000r/min离心1min，弃上清，收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书操作提取DNA；
S2：样品处理，取含有弧菌的样品先接种到3％氯化钠碱性蛋白胨水培养基进行增菌培养，条件为36±1℃培养8～18h，再取增菌液于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖培养基，条件为36±1℃培养18～24h，然后选取生长优势的菌落接种于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，条件为36±1℃培养18h～24h，最后挑选纯培养的单个菌落，接种于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，条件为36±1℃培养18～24h，取上述菌液1～3mL，以10000r/min离心1min，弃上清，收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书操作提取DNA；
S3：PCR扩增，取步骤S2中的待测液体，依次加入25μl2×F8 FastLong PCR MasterMix、2μl浓度均为20μmol/1的上下游引物、5.0μl步骤S1中的菌液模板，并用灭菌水补足至50μl，混合均匀，置于PCR仪上进行DNA扩增，94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15min，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃结束保存；
S4：结果，扩增后的产物经电泳，在紫外线下照射，能检测到弧菌属的细菌均可扩增出分子量为1130bp的目的条带，非弧菌属的细菌均没有扩增到条带。
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