[发明专利]一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括用牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体和HRP标记的IgG酶标二抗；本发明涉及的chr1502蛋白在牛溶血性曼氏杆菌感染宿主的各个时期都有表达，并且在感染的第8天能够检测到相应的抗体产生，其产生的抗体存在的时间较长，特异性强，检测灵敏度高，本发明实现了对早期牛溶血性曼氏杆菌感染的特异性、高灵敏度的检测及疫苗免疫后抗体水平的监测，本发明检测步骤方便操作，检测时间短，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于兽医生物检测技术领域，具体涉及一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

牛溶血性曼氏杆菌病是一种由牛溶血性曼氏杆菌引起的牛呼吸系统疾病。近年来，随着我国肉牛规模养殖的飞速发展，原来低发少发的牛溶血性曼氏杆菌病变得高发频发，仅2015年，全国就有多起犊牛感染溶血性曼氏杆菌病例，其死亡率在20％-50％。牛溶血性曼氏杆菌病常见于运输后犊牛，断奶、长途运输、恶劣天气等是该病的诱发因素。该病呈全世界广泛分布，北美每年由于该病造成的经济损失就达2亿美元以上。

牛溶血性曼氏杆菌是导致牛呼吸道疾病最常见最重要的细菌性病原，该病原菌是一种机会致病菌，正常情况下，可作为一种共生体存在于健康牛上呼吸道，但其含量低。一旦外界环境变化，牛机体受到各种不良应激，其他细菌病毒等因素改变了上呼吸道微生物群落微环境，牛溶血性曼氏杆菌就会快速繁殖，致使该菌向下呼吸道扩展，从而导致肺炎的发生。牛溶血性曼氏杆菌被认为是导致牛严重性或致死性支气管肺炎最常见和重要的致病病原。

精确诊断是控制牛溶血性曼氏杆菌病的关键环节。目前，国内外针对疾病诊断和疫苗效力的检测方法主要有病原分离鉴定、PCR检测技术、琼脂扩散试验、间接血凝试验以及ELISA试验等。PCR检测技术主要用于实验室研究，琼脂扩散试验和间接血凝试验敏感性较低，ELISA检测方法具有灵敏性高和易批量检测等优点。

目前我国尚无用于牛溶血性曼氏杆菌病血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价的ELISA抗体检测试剂盒。因此，寻找特异性抗原靶标，研制一种快速、敏感、特异的ELISA抗体检测试剂盒，以用于疫苗免疫效果评价和疫病血清流行病学调查，对于有效防控牛溶血性曼氏杆菌病具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，解决目前国内没有商品化针对牛溶血性曼氏杆菌抗体水平进行检测的检测试剂盒的技术问题，提供一种能有效评价牛溶血性曼氏杆菌疫苗免疫效果及未免疫牛群溶血性曼氏杆菌感染血清流行病学调查的牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒及其应用，该试剂盒具有快速、特异、敏感、稳定等特点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒，包括用牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体和HRP标记的IgG酶标二抗；所述牛溶血性曼氏杆菌特异chr1502基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体中chr1502基因的筛选方法，具体包括以下步骤：以牛溶血性曼氏杆菌感染小鼠不同时间(8d、12d、16d、21d、48d、120d)的血清作为一抗，以牛溶血性曼氏杆菌菌体总蛋白作为待检抗原，进行western blot，筛选在各时间段内均具有特异免疫反应的蛋白条带，即得到初筛蛋白条带，再将所述初筛蛋白条带进行质谱检测获得多个蛋白信息，根据各蛋白在细胞中分布、抗原表位和分泌特性分析，得到初筛抗原蛋白，再将初筛抗原蛋白在大肠杆菌中表达，以牛溶血性曼氏杆菌感染血清进行Western blot检测，筛选具有强反应原性(灰度值较高)的蛋白条带对应的蛋白，得到候选抗原蛋白，将所述候选抗原蛋白进行ELISA和特异性验证，即筛选获得最终的抗原蛋白chr1502。