[发明专利]一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括用牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体和HRP标记的IgG酶标二抗；所述牛溶血性曼氏杆菌特异性chr1502基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体中chr1502基因采用如下方法筛选：分别以牛溶血性曼氏杆菌感染小鼠8d、12d、16d、21d、48d和120d的血清作为一抗，以牛溶血性曼氏杆菌菌体总蛋白作为待检抗原，进行Western blot，筛选在各时间段内均具有特异免疫反应的蛋白条带，即得到初筛蛋白条带，再将所述初筛蛋白条带进行质谱检测获得多个蛋白信息，根据各蛋白在细胞中分布、抗原表位和分泌特性分析，得到初筛抗原蛋白，再将初筛抗原蛋白在大肠杆菌中表达，以牛溶血性曼氏杆菌感染血清进行Westernblot检测，筛选具有强反应原性的蛋白条带对应的蛋白，得到候选抗原蛋白，将所述候选抗原蛋白进行ELISA和特异性验证，即筛选获得最终的抗原蛋白chr1502。

2.根据权利要求1所述牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体采用如下方法制得：向固相载体中加入浓度为6μg/mL的牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502溶液，于4℃包被过夜后，弃去所述牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502溶液，向固相载体中加入质量浓度为2 %的脱脂奶粉溶液，于37℃下封闭0.5h，即得到牛溶血性曼氏杆菌特异性蛋白chr1502包被的固相载体。

3.根据权利要求1所述牛溶血性曼氏杆菌抗体检测的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所述样品稀释液为含0.5 wt.% BSA、0.05 wt.% 吐温20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L NaCl的PBS缓冲液，所述样品稀释液的pH为7.2；所述浓缩洗涤液为25×PBST洗涤液；所述显色液为TMB，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。