[发明专利]一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法

说明书

本发明公开了一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，包括以下步骤：雨生红球藻的接种和培养；抑制剂对雨生红球藻株处理；虾青素、β‑胡萝卜素和番茄红素标准品的红外光谱采集；藻细胞红外显微光谱的检测；显微红外光谱成像的比较和分析。本发明利用红外显微光谱成像技术，结合类胡萝卜素合成的抑制剂对雨生红球藻细胞进行处理，对虾青素积累过程中藻细胞各类组分含量进行高空间分辨原位观测，以便分析各组分在虾青素合成路径的作用。本发明方法将对藻细胞内类胡萝卜素合成路径的研究以及雨生红球藻的规模化养殖生产虾青素有重要意义。

技术领域

本发明涉及微藻代谢过程研究技术领域，尤其涉及一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡水生的单细胞绿藻，隶属绿藻门、团藻目、红球藻科、红球藻属。细胞为圆形到椭圆形，直径在20-40μm。在整个生命周期中它出现3种典型的细胞形态：绿色营养细胞、黄色中间期细胞和红色孢囊细胞。在合适的生长条件下，雨生红球藻以绿色游动细胞的形式存在进行快速生长，此时细胞内主要含有叶绿素a、叶绿素b以及初级类胡萝卜素，特别是β-胡萝卜素和叶黄素。在环境条件不利时(如强光照、高盐、营养缺乏、低温、干燥、辐射、活性氧诱生剂等)，雨生红球藻以黄色和红色不动细胞为主并伴随着细胞体积的增大和细胞壁的加厚，此时细胞体内的光合速率下降并且各类代谢不平衡，导致碳水化合物的迅速积累，脂肪酸和类胡萝卜素含量增加，特别是虾青素迅速在细胞内积累。与细菌、酵母等其它微生物相比，雨生红球藻被认为是天然虾青素生产的最好来源。虾青素具有抗辐射和防紫外线的功能，可以预防心脑血管疾病、缓解机体疲劳、防癌抗癌等功效，还可以提高饲养动物的免疫力、促进繁殖能力、加快个体生长、预防疾病，它已经成为食(药)品、化妆品、动物和水产养殖的重要添加剂。天然虾青素产品日益受到消费者的青睐，并且已经实现了大规模商业化生产，然而由于国际市场上虾青素供不应求导致价格不断攀升，这就使得利用雨生红球藻进行天然虾青素的生产具备了广阔的市场前景。

虽然雨生红球藻是天然虾青素的最好生物来源，但是野生型的雨生红球藻存在着生长速率低、对培养温度要求苛刻、单位虾青素产量低等缺点。近年来，国内外科研工作者尝试了大量物理、化学和生物的诱变方法，期望得到生长速率快、环境适应能力强和虾青素产量高的新型雨生红球藻株。除了采用微藻育种的方式提高虾青素的产量，还可以通过对雨生红球藻合成虾青素的路径进行分析和研究，掌控好诱导藻细胞内虾青素积累的最适条件，提高虾青素的单位产量，进而降低虾青素的生产成本。

目前有关雨生红球藻细胞内合成虾青素路径的研究主要方法有：①抑制剂阻断类胡萝卜素合成过程中的关键酶的活性，提取和分离中间产物，液相色谱定量分析；②类胡萝卜素合成过程中关键基因表达水平的研究。然而此类方法具有操作复杂、步骤繁琐、检测过程中大量化学试剂的使用易造成环境污染、只能单一组分的分析、无法观测细胞内成分的分布情况等缺点。相比之下，红外显微光谱成像检测具有多方面的优势，适于雨生红球藻虾青素合成过程中各类组分变化的快速分析。

红外光谱(Infrared spectroscopy，IR)是依据分子吸收红外辐射后发生能级的跃迁过程中光谱的振动情况来确定物质基团的结构和化合物的含量等信息。尤其是近十几年随着光谱显微镜技术的快速发展，红外光谱显微成像技术在分类鉴定、生长代谢监测、育种、水环境、食品医药等与微藻相关的领域取得了显著地进展。

可见，随着红外光谱仪的技术进步，基于红外光谱显微成像的检测分析方法日趋成熟。且由于其具有简单、快速、实时动态和无损检测等优势，同时也能够对生物体进行多组分、微观空间的分析的特点，今后一定会受到越来越广泛的关注。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于红外光谱显微成像技术的雨生红球藻虾青素合成过程研究方法，实现了在单细胞水平和微空间尺度上对虾青素积累过程中各类细胞组分变化的研究和分析。