[发明专利]一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法

说明书

本发明公开了一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法，属于酶工程技术领域。本发明采用毕赤酵母表达系统，构建一种表达硫酸软骨素水解酶的方法。本发明在毕赤酵母表达系统中实现了硫酸软骨素水解酶的分泌表达，对硫酸软骨素水解酶的工业化生产起到了重要的推动作用。

技术领域

本发明涉及一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

多糖作为一种高分子碳水化合物，广泛存在于动植物和微生物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性。多糖主要有二糖单位组成，分为硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素。硫酸软骨素(CS)的相对分子质量大小对其发挥生物活性有着重要的影响。由于大分子的多糖体积较大，较难透过细胞膜从而不能很好的在机体内发挥其多种药理功能，而低分子量的CS具有溶解性好、粘度小、易吸收和生物利用度高等特点，因此，近年来低分子量CS的制备及其用途已逐步成为热点。

目前，降低多糖相对分子质量的方法主要有生物降解、化学降解、物理降解和氧化降解。生物降解主要是酶法降解，其特点是安全高效，但成本较高；化学降解可分为无机酸和有机酸，无机酸降解简便易行，成本较低，但污染严重，而有机酸降解相对较安全，但不同的有机酸对多糖的降解效率差异较大；酸法降解所得低分子硫酸基脱除率高达,并伴随有不饱和糖醛酸等不饱和结构产生，产物颜色为橘红色。物理降解主要是超声波降解和辐照降解，其特点是降解过程易控制，无污染；氧化降解以过氧化氢降解为主，其特点是副产物较少，相对分子质量分布较为集中。

酶法降解相对于其它的降解方法，具有反应条件温和、无污染、工艺简单，适合于CS低聚糖的工业化生产，具有较大的优势。但是不同来源的酶对硫酸软骨素降解的机理可能不同，导致最后产生的CS寡糖的结构和功能可能也会有所不同。硫酸软骨素裂解酶，裂解效果含不饱和双键，硫酸软骨素水解酶优势为无不饱和键。

目前还没有软骨素水解酶异源表达的报导：构建分泌酸软骨素水解酶重组菌株的基因来源牛，宿主毕赤酵母Pichia pastoris GS115，质粒pPIC9K，缺陷发酵周期长。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌，所述重组菌是以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主，表达来源于牛的硫酸软骨素水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素水解酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述硫酸软骨素水解酶基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的硫酸软骨素水解酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母Pichiapastoris GS115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母Pichia pastorisGS115/pPIC9K-CHASE。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法在硫酸软骨素水解酶基因上添加组氨酸标签。

本发明的第三个目的是提供一种所述重组菌发酵生产硫酸软骨素水解酶的方法，所述方法在发酵罐中，采用甲醇诱导策略发酵生产硫酸软骨素水解酶。

在本发明的一种实施方式中，发酵方法具体步骤为：