[发明专利]一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法

权利要求书

1.一种分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌，其特征在于，所述重组菌是以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主，表达来源于牛的硫酸软骨素水解酶，所述硫酸软骨素水解酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述硫酸软骨素水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法是：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的硫酸软骨素水解酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K-CHASE。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法还包括在硫酸软骨素水解酶基因上添加编码组氨酸标签的核苷酸序列。

5.一种生产酸软骨素水解酶的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-4任一所述的重组菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法在发酵罐中，采用甲醇诱导策略发酵生产硫酸软骨素水解酶。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：

将摇瓶培养的YPD种子液以体积比为10%的接种量接种于3 L全自动发酵罐中，温度控制在25-30°C，使用25%氨水调节pH为5-6，初始搅拌转速为500-1000 r·min^-1，通气量为2-4L·min^-1，溶氧维持在30%-35%以上，培养20-40 h，OD₆₀₀70-80待甘油耗尽，指数流加质量体积比为30-50%、含12 mL·L^-1PTM1的甘油溶液，搅拌转速与溶氧相关联，控制转速在500-1000 r·min^-1补料12h，停止补料待甘油再次耗尽，OD₆₀₀约250，干重约60.0 g·L^-1，转速在600-1000 r·min^-1并流加100%、含12 mL·L^-1 PTM1的甲醇，甲醇浓度控制在18.0 g·L^-1，诱导温度分别采用30°C，25°C，22°C及阶段控制温度诱导策略。

8.权利要求1所述硫酸软骨素水解酶的分离纯化方法。

9.根据权利要求8所述的分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：离心发酵液，收集上清液，上样；使用Ni柱，用磷酸盐缓冲液平衡柱子10柱体积；采用咪唑梯度洗脱，咪唑用上述磷酸缓冲液配制，按照10 mmol·L^-1，30 mmol·L^-1，200 mmol·L^-1梯度洗脱。