[发明专利]一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物，以及还可以包括如SEQ ID No.4所示的荧光探针，该对引物所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增腐皮镰刀菌，从而将其与常见的同镰刀菌属其它菌种分离开来。基于该对引物的试剂盒和PCR检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性。

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法。

背景技术

腐皮镰刀菌(Fusarium solani)是植物根腐病的主要致病菌，主要对黄芪、丹参、甘草、板蓝根等产生危害。根腐病是一种真菌引起的植物病，该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。腐皮镰刀菌根据其形状、厚垣孢子和长管瓶的存在确定其为大分生孢子，然而形态学鉴定不能区分不同的生物物种和具有共同形态特征而基因多样的有丝分裂菌株，如若采用传统的鉴定方法，容易出现偏差，且耗时较长。

多重PCR检测腐皮镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。

腐皮镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌，为实现PCR反应的高度特异性，需要选择高度保守、特异的序列作为耙序列。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供高特异性的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

进一步地，还包括如序列表SEQ ID No.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒，包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQID No.3所示的下游引物和如序列表SEQ ID No.4所示的探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

进一步地，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。

本发明的目的之三采用以下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的方法，包括以下步骤：

1)获得阳性质粒的标准品：以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；