[发明专利]一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

2.如权利要求1所述的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，还包括如序列表SEQ ID No.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。

3.如权利要求2所述的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

4.一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物和如序列表SEQ ID No.4所示的探针。

5.如权利要求4所述的检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

6.如权利要求4所述的检测腐皮镰刀菌的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。

7.一种用于检测腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)获得阳性质粒的标准品：以腐皮镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；

2)PCR鉴定：分别以待测样品的DNA、阳性质粒的标准品为模板，以ddH₂O为阴性对照，通过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR反应检验。

8.如权利要求7所述的用于检测腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(2.5μM)0.5μL、上游引物(1μM)0.5μL、下游引物(1μM)0.5μL、模板0.5μL、Taq酶(5U)0.5μL和ddH₂O补足25μL；

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

9.如权利要求7所述的用于检测腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增体系包括如序列表SEQ ID No.4所示的探针。

10.如权利要求7所述的用于检测腐皮镰刀菌的方法，其特征在于，PCR反应体系：2×premix 10μL、上游引物(10μM)0.2μL、下游引物(10μM)0.2μL、探针(10μM)0.2μL、模板0.3μL、ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。