[发明专利]用于检测沙门氏菌的RPA引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供用于检测沙门氏菌的RPA引物、探针及检测方法。其引物序列如下：针对iroB基因：上游引物SEQ ID No.1:5’‑GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC‑3’；下游引物SEQ ID No.2:5’‑GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT‑3’。本发明将RPA技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测沙门氏菌。该方法可从常见致病菌中特异性检测到沙门氏菌，对沙门氏菌的快速检测提供了技术支持，同时可以免除昂贵仪器的投入，便于在基层推广使用。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测沙门氏菌的引物、探针及检测方法。

背景技术

沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，作为一种人畜共患病的病原菌，它每年会在全球广泛流行，导致病人出现肠胃炎和伤寒等症状，并给全世界带来巨大的经济损失。因此，开发沙门氏菌的快速检测方法对保障社会的食品安全及人民身体健康具有重要的意义。

目前沙门氏菌的检测方法传统培养方法、基于免疫学原理的方法以及基于分子生物学的方法。传统培养方法对实验设备的要求不高，但是检测周期较长，通常长达五天以上，并且该方法对检测人员的操作要求较高。而免疫学检测方法虽然灵敏度高，但是易受非特异反应干扰。基于分子生物学的方法虽然可以实现对目标菌的快速检测，但是它往往需要依赖昂贵的设备，例如荧光PCR法需要配套价格高达数十万元的荧光PCR仪。这些方法均不利于现场快速检测。

重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年由英国研究人员研发的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，解链模板DNA，引物与模板单链结合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，同时单链DNA结合蛋白与另外一条模板单链结合。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前基于沙门氏菌iroB基因的引物和探针及检测方法并没有被应用于沙门氏菌的检测应用中。

目前多种沙门氏菌的基因被作为靶基因应用于沙门氏菌的检测中，但是大多数靶基因的特异性并不理想。iroB基因是一种特异性良好的沙门氏菌种特异性靶基因，针对该基因建立的PCR法可以特异检测出各血清型的沙门氏菌，并且该方法对其他肠道微生物的检测结果全都为阴性。因此基于沙门氏菌iroB基因的RPA引物和探针及RPA检测方法在对沙门氏菌的检测中将有着优良的特异性。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于检测沙门氏菌的RPA引物，其引物序列如下：针对iroB基因：

上游引物SEQ ID No.1:5’-GGAATGTCATACTTAGCGGGTTTGACACGAGC-3’

下游引物SEQ ID No.2:5’-GGTGGTATTTGACGCTGGCGGTGCAAACCT-3’。

优选的，采用上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。

本发明提供一种用于检测沙门氏菌的RPA探针，其序列如下：

针对iroB基因的探针：

SEQ ID No.3:5’-CGCTGAAGAATGAGAAGTTCCCCAAAATGTGGAAACATTAAATC-3’。