[发明专利]用于检测无乳链球菌的RPA引物、探针及检测方法

说明书

本发明提供用于检测无乳链球菌的RPA引物、探针和检测方法。其引物序列如下：针对SIP基因：上游引物SEQ ID No.1：5’‑CACCGGTAAGAACTGTAGCAGCCCCTAGAGTG‑3’下游引物SEQ ID No.2：5’‑CTTCAGTCGCTTGTAACTTACTGTCTGTAGC‑3’。本发明的有益效果包括：（1）本发明将RPA技术与荧光检测相结合，可以快速准确的检测无乳链球菌。（2）本发明特异性强，灵敏度高，可在恒温37‑42℃下进行反应，大大减少了对于昂贵温控设备的要求，且在20min内完成反应，可以快速的对无乳链球菌进行检测，具有较高实用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及用于检测无乳链球菌的引物、探针及检测方法。

背景技术

无乳链球菌又称为B组溶血性链球菌，是革兰氏阳性菌，成对或呈短链状排布。无乳链球菌一直是新生儿和女性生殖道感染的重要病原菌，特别是其引发的新生儿脑膜炎和败血症，严重威胁新生儿生命安全。同时国标GB4789.11-2014《食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验》规定了对食品中无乳链球菌的检测。因此，开发无乳链球菌的快速检测方法有着重要的现实意义。

目前无乳的检测方法传统培养方法，免疫学方法以及PCR方法。虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，成本低廉，但是检测的周期较长，检测效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。而免疫学检测方法存在非特异反应，虽然灵敏度高，但缺乏特异性，易发生交叉反应。PCR检测方法的不足之处在于需要昂贵的温控仪器，检测时间相对较长。这些方法均不符合现场快速检测的要求。

重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是2006年提出的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有被应用于无乳链球菌的检测应用中。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于检测无乳链球菌的RPA引物，其引物序列如下

针对SIP基因：

上游引物SEQ ID No.1：5’-CACCGGTAAGAACTGTAGCAGCCCCTAGAGTG-3’

下游引物SEQ ID No.2：5’-CTTCAGTCGCTTGTAACTTACTGTCTGTAGC-3’。

优选的，采用上游引物、下游引物中的至少一种，或选自该引物碱基序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。

优选的，所述下游引物Seq ID No.2在5’端进行biotin修饰。

本发明还提供一种用于检测无乳链球菌的RPA探针，其序列如下：

SIP基因的探针：

5’-AAGTAGAAACTGGTGCATCACCAGAGCATGTATCAGCTCCAGCAG-3’。

其长度为45-52bp，探针的5’端30bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团ROX和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端也需要通过阻塞基团C3Spacer修饰。

优选的，所述探针采用探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。