[发明专利]一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

说明书

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，涉及酶的基因工程技术领域。本发明公开了由米曲霉(Aspergillus oryaze)脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在这个突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为：Gly57Glu。以该突变体在不同温度条件下保温10min后失去50％酶活力的温度(T_50％¹⁰)及50℃的半衰期(t₅₀^1/2)表示，该突变体的热稳定性得到了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

近年来，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、环境友好等优点，已经在洗涤、造纸、制革、食品、纺织等领域得到了广泛的应用，并已经成为全球酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动、植物中提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，便于工业生产和提纯，所以在各领域中得到了极为广泛的应用中。米曲霉是一种非常安全的产酶菌，目前已经被美国FDA和WHO认定为安全菌株(GRAS)，它所分泌的脂肪酶AOL3(GenBank AB039325)具有安全无毒，作用底物广，对中、长链的甘油三脂的选择性高等优势(Toida J,FukuzawaM,Kobayashi G,Ito K, Sekiguchi J.Cloning and sequencing of thetriacylglycerol lipase gene of Aspergillus oryzae and its expression inEscherichia coli.FEMS Microbiol Lett. 2000,189:159-164.)，在食品、洗涤和生物柴油领域展现出了重要的应用潜力。但是很多食品、洗涤剂以及生物柴油的制备或者使用过程都需要在较高温度下进行，而AOL3属于中温脂肪酶，在50℃下的半衰期不到2min，热稳定性差。这不仅显著地提高了AOL3的应用成本，而且限制了它的应用领域，急需对其热稳定性进行改良和提高。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过随机突变人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。近10年来，定向进化技术已经在脂肪酶性质改造领域取得了巨大的成功，主要集中于提高酶的热稳定性，提高酶的催化活力，改进底物特异性，对应立体选择性等方面(Katja Zorn,Isabel Oroz-Guinea, Henrike Brundiek,Uwe T.Bornscheuer.Engineering and application ofenzymes for lipid modification,an update.Prog Lipid Res.2016,63:153-164)。

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期研究中，发明人已经成功将米曲霉脂肪酶AOL3在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌为表达系统，利用易错PCR和定向进化技术对米曲霉脂肪酶AOL3进行大量随机突变和筛选，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

酶分子的热稳定性提高可以用半衰期(t^1/2)来表征。即在较高温度条件下，酶的活力降低到原来活力一半时所需的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，热稳定性差。因此，t^1/2的提高代表了酶分子热稳定性的提高。本发明中的t₅₀^1/2表示在50℃条件下，脂肪酶及其突变体的半衰期。

酶分子的热稳定性提高还可以用T_50％¹⁰来表征。即在不同温度条件下对酶分子孵育10min，获得酶分子活力失去50％的温度，此温度越高表示酶分子热稳定性越强。