[发明专利]一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法

说明书

本发明涉及一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述无血清培养基由基础培养基，牛血清白蛋白，皮质醇，胰岛素，转铁蛋白，谷胱甘肽，胰蛋白酶，牛磺酸和亚硒酸钠组成，其中牛磺酸和亚硒酸钠的重量份配比比例为2‑3:1。该方法不添加动物血清，极大地降低了生产成本，提高了生产的经济效益，并且还避免了血清使用所带来的诸多问题。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法。

背景技术：

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性和高度传染性的肠道病毒性疾病,其症状包括腹泻，呕吐，厌食，脱水和仔猪体重减轻。虽然不同年龄段的猪都可能受到不同程度的感染并出现症状，但仔猪的病情特别严重，其中死亡率高达100％，PEDV主要通过小猪的肠粘膜表面进入宿主，主要导致肠上皮细胞损伤。虽然不同年龄段的猪都可能受到不同程度的感染并出现症状，但仔猪的病情特别严重，其中死亡率高达100％，PEDV主要通过小猪的肠粘膜表面进入宿主，主要导致肠上皮细胞损伤。针对PEDV的大爆发，我们通常可以采用疫苗策略来控制PEDV，并且在中国已经广泛开展了用杀死或减毒的PEDV疫苗进行疫苗接种，在一定程度上控制了PEDV的大规模爆发。但随着中国PEDV灭活或减毒二联疫苗的广泛使用，PED在全国范围内持续蔓延至2010年10月，当时出现变异株，PEDV感染急剧增加，严重危害养猪业。虽然国内用于流行性腹泻的疫苗（包括二联灭活苗及二联活疫苗）得到了广泛的推广和应用，并且在一定范围和程度上减少了猪流行性腹泻的发病率，但是该病仍然未能得到完全控制，尤其在2010年10月至今，该病呈持续性，爆发性增长趋势。

通常，PEDV采用vero细胞进行培养和增殖，进而灭活制备得到PEDV灭活疫苗。目前，基于vero细胞培养PEDV疫苗的生产过程多采用两阶段操作工艺， 即：前期在有血清的培养基中使细胞增殖至所需密度；后期通过洗涤去除血清成分及代谢废物，更换为低血清或无血清培养基以支持病毒在细胞中感染和复制。然而，现有疫苗生产中，前期vero细胞的培养液以商业化的培养基配合小牛或者马血清进行培养和生产。血清组分的复杂性和不确定性及批次间的差异增加了疫苗等细胞产品生产及质量控制的难度，同时血清易引起细菌、真菌、病毒及支原体的污染，增加了疫苗生产的安全性隐患。并且血清本身价格也比较昂贵，这些均使得血清在PEDV疫苗的生产和研究中的应用存在诸多不利。实践已证明无血清培养基不仅能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷 , 也能取得较好的培养效果。并且由于其明确的成分组成, 可避免血清的不同批次或不明组分对细胞培养及试验研究的影响 , 从而提高结果的可重复性。因此, 基于PEDV疫苗生产中血清使用所存在的诸多问题以及生产成本高昂，因此，尽量减少血清的用量一直是疫苗生产中研究的课题，低血清以及无血清培养基的开发和应用势在必行。

发明内容：

为解决以上技术问题，及现有技术中血清使用所存在的诸多问题以及生产成本高昂，本发明旨在提供一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，该培养基不添加动物血清，极大地降低了生产成本，提高了生产的经济效益，并且还避免了血清使用所带来的诸多问题。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：

一种利用无血清培养基生产PEDV灭活疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤（1），Vero细胞的复苏；

步骤（2），Vero细胞的传代扩增；

步骤（3），在Vero细胞上接种PEDV病毒毒株；

步骤（4），收获感染细胞培养上清液，病毒液进行澄清过滤；

步骤（5），灭活，即制备得到PEDV灭活疫苗；