[发明专利]一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法

说明书

本发明公开了一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法，包括以下步骤：（1）提取肿瘤成纤维细胞；（2）分离单细胞并进行裂解；（3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；（4）以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；（5）对构建的cDNA文库进行高通量测序；（6）测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤成纤维细胞特异性的标记分子。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。

背景技术

肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。CAF可以募集内皮祖细胞到肿瘤局部促进肿瘤新生血管的生成和肿瘤的生长。这些肿瘤相关成纤维细胞除了表达vimentin这一成纤维细胞的标记物外，还特异性表达FAP、-SMA，但不表达CK、desmin，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常成纤维细胞（NF）存在明显差异。

肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，很多机制尚存在争议，但是普遍认为该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系。肿瘤相关成纤维细胞能分泌趋化因子12（CXCL12）和肝细胞生长因子（HGF），前者能直接刺激肿瘤细胞进行增殖和转移，后者导致细胞外基质（ECM）的改变，进而造成体内上皮细胞增殖和发生恶性转化。除此之外，CXCL12和HGF与肿瘤分泌的血管内皮生长因子（VEGF）一起影响肿瘤新生血管的生成。以此方式，肿瘤相关成纤维细胞能同时影响正常上皮细胞和肿瘤细胞的旁泌性因子来影响肿瘤的发生发展，越来越多的证据表明肿瘤基质中成纤维细胞的突变往往发生在癌症发展之前。

以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。我们利用单细胞测序技术在肿瘤成纤维细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子，为肿瘤的靶向治疗提供新的靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1）提取肿瘤成纤维细胞；

2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，从mRNA水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子。

优选的，以上所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的成纤维细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子。

本发明的具有突出的实质性特点和显著的进步：

通过利用单细胞测序技术，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供一种新的思路和方法。

附图说明