[发明专利]一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用

说明书

本发明属于皮肤细胞损伤修护技术领域，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。通过在特定的温度以及分离条件下，采用多阶段递增离心的方式执行3次以上的离心去除沉淀，直至获得所需的人肌肉细胞外泌体产品，制备方法简单易行。本发明提供的人肌母细胞外泌体来源于人肌母细胞，含有脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，对皮肤日常维护和损伤具有明显促修复作用，肌母细胞外泌体制作成冻干粉，便于储存和运输，亦可制作成各种护肤品或药物制剂使用，为人肌母细胞外泌体对皮肤保养和皮肤损伤修复提供可能。

技术领域

本发明属于皮肤细胞损伤修护技术领域，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。

背景技术

皮肤老化和皮肤粘膜损伤在日常生活极为常见，创面可大可小，可深可浅，损伤部位各不相同。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但存在皮源紧张、易感染和巨大疤痕形成等问题。

近年来，细胞治疗皮肤粘膜损伤的医学研究得到广泛关注，特别是干细胞可以通过分化为皮肤细胞、汗腺细胞和旁分泌促进皮肤创伤的修复，在皮肤粘膜损伤修复中具有临床应用前景。然而，干细胞植入体内后定向分化仍有许多问题需要解决，长期应用安全性(如癌变、骨化等)问题不容乐观，而且活细胞的使用存在储存和运输困难等问题，因此寻找能够替代干细胞在组织损伤修复中起作用的细胞制品或细胞因子显得十分迫切。

外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的直径在40-100nm，密度在1.10-1.18g/ml的囊泡小体。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此外泌体在多种疾病中扮演生物标志物的角色。目前将外泌体应用于损伤修复领域，主要来源为各种干细胞。例如通过体内外实验发现，在二级烧烫伤动物模型中，人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-Ex)能够增强伤口处的血管再生和修复，这一效果是通过Wnt4/β-Catenin途径实现的(Stem Cells Transl Med.2015,4(5):513-522.)。随后该团队进一步报道，人类脐带间充质干细胞外泌体中14-3-3zeta可介导YAP和P-LATS结合形成一个复合物促进YAP的磷酸化，与皮肤再生过程中外泌体Wnt4信号通路相互协作，hucMSC-Ex不仅可作为Wnt/β-catenin信号的“加速器”以促进受损皮肤组织的再生修复，而且可通过调节YAP控制皮肤再生作为该信号的“刹车”(Stem Cells.2016,34(10):2485-2500)。然而，作为仅有的外泌体来源的干细胞外泌体产量很低，而大面积烧烫伤临床用药需求大，因此亟需寻找到新的外泌体细胞来源。

另一方面，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤和试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。超速离心法是最常用的外泌体分离手段，使用低速离心和高速离心交替进行的方法，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超速离心法因操作简单，获得的囊泡数量较多且不会影响外泌体的粒径而广受欢迎。但是超速离心法耗时长，回收率不好控制，另外操作不当还会导致得到的外泌体纯度受到影响，离心条件控制不当，重复离心操作也会对囊泡造成一定程度的损伤，降低获得的囊泡质量。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法及其应用，其充分结合外泌体在皮肤损伤修护应用中的特点和需求，针对性对外泌体的提取源、提取方法进行重新设计，相应获得了一种提取纯度高、质量好的人肌母细胞外泌体提取方法，而且将该肌母细胞外泌体用于皮肤损伤修复时取得了良好的效果，由此解决了现有高速离心法提取外泌体时由于离心条件控制不当造成的外泌体纯度以及质量受到影响，以及现有的干细胞体外培养产量低，不能满足应用需求的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。