[发明专利]一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法

说明书

本发明公开了一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，包括如下工艺步骤：拟鉴定基因表达预测；拟鉴定基因高表达样品的采集和RNA提取与反转录；转录组测序；转录组数据分析与存储；转录组数据的调取；基因鉴定引物的设计与基因鉴定。具体是通过近缘物种的研究报告分析，测定待鉴定基因表达丰富样本的转录组，再在转录组中筛选待鉴定基因的目的序列，并以此为基础进行基因的鉴定克隆，得到准确的基因序列。本技术手段适用于大多数真核生物的功能基因鉴定，十分准确，满足了研究过程功能基因鉴定的研究需求。本发明设计合理，使用简单，成本相对较低，适合推广使用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法。

背景技术

自人类基因组测序完成以来，越来越多的生物的基因组测序完成。基于基因组鉴定生物基因相对容易。然而，完成基因组测序的物种所占比例极小，大部分的物种都需要通过同源克隆的方式鉴定物种本身的基因。同源克隆对于近缘物种中已鉴定得到对应基因的情况下，效果较好。然而，在鉴定物种间一致性低的基因以及一些进化地位特殊的物种的基因时，同源克隆往往无法达到令人满意的效果。这是往往需要分析基因的保守位点，设计兼并引物，可能同时需要几对，甚至十几对的引物才能获得目的基因。大大增加了鉴定的经济成本和时间成本。

转录组是继基因组学后另一大组学研究热点。由于转录组测序技术的发展，以及转录组测序和数据分析相对基因组简单，转录组测序成本远远低于基因组测序。转录组测序理论上能够获得某个样本中全部表达的基因的序列。因此，一次转录测序构建的数据库可为成千山万个基因的鉴定提供基础数据库。转录组测序的成本平摊到每一个基因的鉴定上低至几毛钱至几元钱，这远远低于多次引物的设计合成成本。

发明内容

本发明提供一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，可以有效解决上述背景技术中的问题。

本发明的技术方案概述如下：

一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，包括如下工艺步骤：

第1步，拟鉴定基因表达预测：首先利用基因的基本信息，以及其在其他物种中的研究结果预测待鉴定基因本身的表达的情况，确定待鉴定基因高表达的时空信息；

第2步，拟鉴定基因高表达样品的采集和RNA提取与反转录：待鉴定基因高表达样品的要求为，待鉴定基因的表达量高，样品容易采集且RNA容易提取，根据此要求，利用真核生物特有的Poly A富集RNA，片段化RNA后反转录得到所需的cDNA文库；

第3步，转录组测序：使用高通量测序平台对cDNA文库进行测序；

第4步，转录组数据分析与存储：对cDNA文库的转录组数据质控、拼接，并进行功能注释，注释结果保存于EXCEL；

第5步，转录组数据的调取：利用EXCEL的搜索功能，以待鉴定基因为关键词进行搜索，将需要鉴定的基因名在功能注释的EXCEL中搜索定位其在转录组中的位置，调出对应的转录组序列，若找到多个序列，则进行序列比对，筛选正确的序列用于引物设计；

第6步，基因鉴定引物的设计与基因鉴定：根据筛选到的序列对序列进行整理分析，预测其CDS并设计序列特异性引物，进行基因鉴定。

优选的是，所述第1步中具体可使用相关的查询数据库，如THE HUMAN PROTEINATLAS(https://www.proteinatlas.org)，此外，一些特殊的物种可参考其近缘物种的研究报告。

优选的是，所述第2步中的RNA提取过程中利用OligoT富集包含Poly A的全部RNA，并使用但不限于agilent 2200检测RNA和cDNA文库质量。