[发明专利]一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法

权利要求书

1.一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：

第1步，拟鉴定基因表达预测：首先利用基因的基本信息，以及其在其他物种中的研究结果预测待鉴定基因本身的表达的情况，确定待鉴定基因高表达的时空信息；

第2步，拟鉴定基因高表达样品的采集和RNA提取与反转录：待鉴定基因高表达样品的要求为，待鉴定基因的表达量高，样品容易采集且RNA容易提取，根据此要求，利用真核生物特有的Poly A富集RNA，片段化RNA后反转录得到所需的cDNA文库；

第3步，转录组测序：使用高通量测序平台对cDNA文库进行测序；

第4步，转录组数据分析与存储：对cDNA文库的转录组数据质控、拼接，并进行功能注释，注释结果保存于EXCEL；

第5步，转录组数据的调取：利用EXCEL的搜索功能，以待鉴定基因为关键词进行搜索，将需要鉴定的基因名在功能注释的EXCEL中搜索定位其在转录组中的位置，调出对应的转录组序列，若找到多个序列，则进行序列比对，筛选正确的序列用于引物设计；

第6步，基因鉴定引物的设计与基因鉴定：根据筛选到的序列对序列进行整理分析，预测其CDS并设计序列特异性引物，进行基因鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第1步中具体可使用相关的查询数据库，如THE HUMAN PROTEIN ATLAS(https://www.proteinatlas.org)，此外，一些特殊的物种可参考其近缘物种的研究报告。

3.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第2步中的RNA提取过程中利用OligoT富集包含Poly A的全部RNA，并使用但不限于agilent 2200检测RNA和cDNA文库质量。

4.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第3步中的高通量测序平台包括但不限于HiSeq-2500、Hiseq-2000、罗氏454和Ion torrent。

5.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第4步中的质控包括错误率的分布、Reads的组成、cleandata数据；拼接使用Trinity中三个独立的模块进行，即茧(Inchworm)、蛹(Chrysalis)、蝶(Butterfly)；基因功能注释则使用七大数据库进行，包括Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO；所述第4步中的注释结果包括但不限于拼接转录本信息、Corset转录本层次聚类信息，以及功能注释结果。

6.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第5步中的EXCEL的搜索功能定位是使用Ultraedit软件的搜索功能定位所需要的序列，所述第5步中序列比对采用MEGA进行，并使用NCBI的Blast功能进行验证。

7.根据权利要求1所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，所述第6步中的序列整理的格式为.fasta格式，序列的整理分析使用MEGA软件；引物设计使用但不限于premier primer、Oligo、Vector NTI Suit、Dnasis、Omiga和Dnastar；根据引物是否添加酶切位点及PCR酶的特性选用适当的克隆载体完成基因鉴定。

8.根据权利要求6所述的一种基于转录组的准确高效的真核生物基因鉴定方法，其特征在于，执行引物的PCR，胶回收PCR产物，克隆到适宜的载体中，对克隆菌液进行测序，测序结果用DNAstar软件包分析，拼接，分析结果在NCBI中比对确定鉴定基因的准确性，完成基因鉴定，其克隆的载体使用但不限于PMD19-T、PMD18-T。