[发明专利]一步纯化固定化ɑ-氨基酸脂酰基转移酶的方法

说明书

本发明涉及酶固定化技术领域，具体公开一种一步纯化固定化ɑ‑氨基酸脂酰基转移酶的方法，通过对ɑ‑氨基酸脂酰基转移酶进行醛基化标记，并在宿主细胞内对ɑ‑氨基酸脂酰基转移酶和甲酰甘氨酸合成酶进行同步诱导，得到高表达量的菌株，将菌体破碎取上清，与氨基载体混合后即可一步实现ɑ‑氨基酸脂酰基转移酶的固定化，无需额外的纯化步骤。本发明方法节省了操作步骤，并保证了目标蛋白的表达，且用普通的氨基载体即可固定化，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及酶固定化技术领域，具体涉及一种一步纯化固定化ɑ-氨基酸脂酰基转移酶的方法。

背景技术

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控，工艺简便等一系列优点。而且具有节省资源与能源、减少或防治污染，符合可持续发展的战略要求。

固定化酶技术可分为吸附法、结合法、交联法、和包埋法。其中共价结合法由于其固相载体与酶分子间以更加稳定的共价键相连接，使用过程中酶不容易脱落而得到广泛应用。酶和载体的共价结合主要由载体表面的活性功能基团和酶表面的活性氨基酸残基，通过化学反应而结合。但是这种结合一般是载体随机地和蛋白质氨基酸残基的氨基等基团结合，而缺少目标蛋白特异性和结合位点特异性，易造成非特异结合。在这种情况下，为了提高固定化酶酶活，一般需要对目的蛋白进行纯化，增加了操作步骤和成本。另外随机结合会引起部分酶分子的失活，影响固定化过程中的酶活收率。

目前已有一些研究通过对酶进行基因修饰以解决其结合位点不特异的问题，可省去后续的纯化步骤，克服目前传统酶固定化方法的一些问题，但这些方法也存在一定缺陷。首先在工程菌构建过程中，需要同时转入两个蛋白基因，一个为目标酶，即脂肪酶基因，另一个为FGE(formylglycine generating enzyme，甲酰甘氨酸合成酶)基因。两个基因使用两套诱导表达体系，在表达过程中，首先利用阿拉伯糖对FGE基因进行诱导表达，一段时间之后才对脂肪酶进行诱导，这种分步诱导的方式容易造成脂肪酶的表达量相对较低，降低生产效率。另外，这些研究中使用的固相载体生产工艺复杂，使用成本较高，不易在固定化酶生产领域获得普及，不适用于工业化固定化酶的生产。

α-氨基酸酯酰基转移酶能够以氨基酸甲酯为酰基供体，氨基酸为亲核物质生成二肽，仅产生一种二肽副产物，也能够以氨基酸甲酯和二肽为底物生成多肽，在生化药品及营养素的制备中具有重要的应用价值。目前还没有通过基因修饰以实现α-氨基酸酯酰基转移酶一步纯化固定化的相关报道。

发明内容

针对以上技术现状，本发明的目的是提供一种经济有效的一步纯化固定化ɑ-氨基酸脂酰基转移酶的方法。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种改进的一步纯化固定化ɑ-氨基酸脂酰基转移酶的方法，包括以下步骤：

(1)将ɑ-氨基酸酯酰基转移酶基因与醛基化标签基因融合；

(2)将步骤(1)融合后的基因和甲酰甘氨酸合成酶基因分别连接到原核表达载体上；

(3)将构建好的载体转入宿主细胞，对两种酶进行同步诱导表达；

(4)离心收集诱导完的菌体，破碎后离心收集上清，与氨基载体混合进行固定化。

优选地，所述ɑ-氨基酸酯酰基转移酶基因来源于鞘氨醇杆菌属，所述甲酰甘氨酸合成酶基因来源于肺炎链球菌属。

优选地，步骤(1)具体为：在所述ɑ-氨基酸酯酰基转移酶基因的起始密码子前或终止密码子前加编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。