[发明专利]一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片，其特征在于：

所述蛋白质芯片是在固相载体的表面点阵固定有探针；所述固相载体为氨基十六烷硫醇和活化槐糖脂化学修饰的金箔芯片；

所述探针包括受体sCD25蛋白、配体IL-2蛋白、sCD25抗体或IL-2抗体；

槐糖脂酸化后的羧基用EDC和NHS活化后与氨基十六烷硫醇进行连接；

所述用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片是通过包括如下步骤的方法制备获得：

步骤1：固相载体的制备

将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml无水乙醇中获得修饰液1；将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2，在所述修饰液2中EDC浓度为150mM，NHS的浓度为50mM；50ug/ml的槐糖脂溶液作为修饰液3；

对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育8-12h，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后将所述修饰液2倒入修饰液3中，室温下反应1小时后点样于所得芯片上并于室温下孵育3小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体；

步骤2：探针溶液的配制

所述探针溶液包括受体sCD25蛋白溶液、配体IL-2蛋白溶液、sCD25抗体溶液或IL-2抗体溶液，配制过程如下：

将受体sCD25蛋白溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的受体sCD25蛋白溶液；

将配体IL-2蛋白溶于0.1M的乙酸-BSA溶液中，配制浓度≥6.25μg/ml的配体IL-2蛋白溶液；

将sCD25鼠抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥25μg/ml的sCD25抗体溶液；

将IL-2兔抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度≥12.5μg/ml的IL-2抗体溶液；

步骤3：探针的包被

将所述探针溶液点样于步骤1获得的固相载体上，室温下孵育2小时，PBST溶液清洗、氮气吹干，然后将PBST-BSA溶液点样于所得固相载体上，室温下孵育1小时，以封闭剩余的已活化羧基，最后用PBST溶液清洗、氮气吹干，即可获得探针包被的蛋白质芯片；

步骤1中，所述修饰液2和修饰液3的体积比为1:2。

2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于：

步骤1中，对金箔芯片进行清洗的过程如下：

将金箔芯片浸入丙酮中浸泡1小时，然后置于H₂O、氨水及H₂O₂溶液按体积比5：1：1混合构成的TL1清洗液中，82℃下水浴6分钟，清洗2次，取出后依次用超纯水和无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。

3.根据权利要求1所述的蛋白质芯片，其特征在于：

所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配制而成的，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％；

所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1％，胎牛血清BSA的质量浓度为0.1％。

4.一种权利要求1-3任一所述的蛋白质芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：

(1)将待检测患者血清稀释4-40倍，然后分别点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温条件下孵育1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；

(2)将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液；

(3)将浓度不低于25μg/ml的sCD25羊抗人多克隆抗体溶液点样于步骤1获得的孵育过血清的配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下孵育1小时；随后将IgG荧光二抗溶液点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上，常温下避光孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；通过芯片扫描仪进行扫描检测，若包被配体IL-2蛋白探针处呈现荧光色，则表明待测患者血清中含有游离受体sCD25蛋白并与包被配体IL-2蛋白探针进行了反应；若包被配体IL-2蛋白探针处无荧光色，则表明待测患者血清中不含有受体sCD25蛋白。