[发明专利]一种用于检测甘薯茎腐病菌的引物对及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测甘薯茎腐病菌的引物对及其检测方法，属于生物技术领域。所述的引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明通过生物信息学手段获取达旦提狄克氏菌的特异性基因片段，并设计用于PCR扩增该基因片段的特异性引物对，利用该引物对实现对达旦提狄克氏菌的准确鉴定，对甘薯茎腐病菌DNA的最低检测浓度达到0.5ng/μL。利用本发明提供的检测方法可以快速准确鉴定甘薯样品中的甘薯茎腐病菌，无需病原菌培养、性状分析等复杂操作。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测甘薯茎腐病菌的引物对及其检测方法。

背景技术

甘薯是世界第六大主粮，中国是世界上最大的甘薯生产国，2006～2010年甘薯种植面积稳定保持在3.70×106hm²左右，占世界甘薯种植面积的45.1％，年平均产量约7.8×107t，占世界甘薯产量的75％左右，总产量在国内仅次于水稻、小麦和玉米，在中国国民经济中占有重要地位。

甘薯细菌性茎腐病于1974年首次在美国发现，后来在日本以及南美洲的委内瑞拉国也有报道。近年来，福建、广东、江西、广西、重庆、河北、河南和浙江等地甘薯相继发生细菌性茎腐病，造成严重损失，如2015年浙江省台州市黄岩区的甘薯种植田中甘薯茎腐病病株率在10％～20％左右，严重的田块高达90％以上，甚至绝收。甘薯茎腐病正严重威胁着我国甘薯产业的健康发展。

甘薯茎腐病典型症状为茎和叶柄上产生褐至黑色水渍状病斑，直至茎基部发黑、变软腐烂，叶发黄，茎和块根维管束呈黑褐色，块根会腐烂、有臭味，田间病薯表面有黑色边的棕色凹陷病斑。病薯、病蔓、田间灌溉水及受污染的器材可作为初侵染源进行传播，潮湿温暖的条件易引发病害。

甘薯茎腐病由达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起。D.dadantii革兰氏染色为阴性，无芽孢和荚膜，能运动，在营养琼脂平板上菌落表面稍凸，不透明，边缘整齐，淡土黄色，表面稍皱缩，无光泽。除甘薯外，D.dadantii还能引起多种作物和观赏植物腐烂，是一种毁灭性的细菌性病害。

目前国内外对甘薯茎腐病菌检测的研究较少。少数研究根据传统的病害症状、病原菌的形态特征、培养性状、生理生化分析和16S rDNA序列分析等方法检测病菌，存在工作量大、鉴定周期长且只能在病害显症后进行鉴定的问题。鉴于甘薯茎腐病严重的危害性和迫切的检疫需求，急需研发特异性强、灵敏度高、成本低的快速检测D.dadantii的方法。

达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)原属于菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)。E.chrysanthemi在被分类到果胶杆菌属(Pectobacterium)改称菊果胶杆菌(P.chrysanthemi)后，又于2005年被分类到Dickeya属，被分成5个种(D.chrysanthemi，D.dadantii，D.dianthicola，D.dieffenbachia和D.zeae)，再后D.dieffenbachia被分类为D.dadantii的一个亚种(D.dadantii subsp.dieffenbachia)。现在的Dickeya属包括8个种(D.aquatica，D.chrysanthemi，D.dadantii，D.dianthicola，D.fangzhongdai，D.paradisiaca，D.solani和D.zeae)。用传统的形态学和生理生化分析的方法难以区分Dickeya属的不同种，以前针对E.chrysanthemi的分子检测手段不适用于特异检测D.dadantii。且由于Dickeya属的种间差异较小，针对达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)很难设计种特异性引物，目前国内外文献未见有相关报道，因此，很难应用PCR的方法对甘薯茎腐病菌进行检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够特异性准确鉴定达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)的方法，以实现对甘薯茎腐病的准确快速检测。