[发明专利]PCV-3免疫评价与野毒感染诊断的免疫速测试剂盒

权利要求书

1.一种用于新发圆环病毒3型(PCV-3)疫苗免疫评价与野毒感染诊断的试剂盒，该试剂盒包括免疫速测卡、血清稀释液、移液管和干燥剂；所述免疫速测卡包括扇形底板，在扇形底板的相对两边表面上分别沿径向设有检测试纸I和检测试纸II，在扇形底板的圆心处设有金标孔，邻近金标孔设置有加样孔，加样孔分别通过第I样品引流道和第II样品引流道与检测试纸I和检测试纸II连接；

其中，检测试纸I设置有检测线和质控线，分别包被PCV-3 Cap蛋白和兔免疫球蛋白IgG抗体；检测试纸II设置有检测线和质控线，分别包被PCV-3 Rep蛋白和兔免疫球蛋白IgG抗体；金标孔中包被有链球菌G蛋白(SPG)胶体金颗粒标记偶联物。

2.一种如权利要求1所述的免疫速测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)Cap和Rep蛋白制备

采用基因工程方法合成去除核定位信号区域的Cap蛋白和Rep蛋白基因序列，并进行密码子优化，采用大肠杆菌表达载体pET-30a进行Cap和Rep蛋白的原核表达，采用柱亲和层析法纯化蛋白，最终获得纯化的表达产物；

(2)免疫速测卡的制备

将Cap蛋白、Rep蛋白、兔免疫球蛋白IgG抗体分别用包被缓冲液稀释后形成喷涂液；用喷膜仪在包被膜上分别喷涂划线相应喷涂液，形成检测线I、检测线II和质控线；

(3)金标孔的制备

取双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入浓度为1％的氯金酸溶液至终浓度为0.02％；煮沸5分钟，之后加入浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，加样体积为氯金酸溶液的2倍；煮沸20分钟后，形成酒红色澄清溶液，停止加热冷却至室温，再用双蒸水调整浓度为0.02％，形成胶体金溶液；

用0.1mol/L碳酸钾调节调节胶体金溶液PH至8.0，逐滴加入SPG蛋白，每mL胶体金溶液加入60ug抗体，混匀后静置5分钟；再加入10％牛血清白蛋白溶液，至终浓度1％，混匀后静置5分钟；10000rpm离心20分钟，弃去上清，用洗涤液洗涤1次；沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标蛋白保存液溶解，然后按照20uL/孔的量加入金标孔中；真空干燥3小时，置装有干燥剂的密封袋中保存备用；

(4)免疫速测卡组装

将检测试纸I、II分别固定在扇形底板的相应卡槽内，将金标孔固定于扇形底板的圆心处，形成免疫速测卡；

(5)血清稀释液制备

称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g,KH₂PO₄ 0.24g，溶于900mL双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用；

(6)试剂盒制备

用铝箔袋将免疫速测卡和干燥剂封口包装，和移液管、血清稀释液一起组装成试剂盒，用于评价新发PCV-3疫苗免疫效果和诊断野毒感染。