[发明专利]一种建立水稻悬浮细胞系的方法及其制备工艺

说明书

本发明公开了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，包括以下步骤：(1)接种用胚性愈伤组织的获得；(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；(4)添加新鲜培养基，将收集的沉淀物悬浮培养，继代培养多次后，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清；(5)吸取培养液中的小颗粒进行继代培养，添加培养基，继代2次后，转入不同培养基中继代，吸取其中小颗粒继代培养数天，即获得水稻悬浮细胞系。本发明提供了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，可以缩短悬浮细胞培养进程，提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。

技术领域

本发明属于水稻组织细胞培养技术领域，具体涉及一种建立水稻悬浮细胞系的方法。

背景技术

悬浮细胞培养是一种重要的植物生物技术，通过悬浮培养获得的悬浮细胞系是植物生理生化研究、原生质体分离和生物工程的重要材料。

在水稻中，一般胚性悬浮细胞系的建立要经历如下步骤：

首先是愈伤组织的准备，要求用于接种的愈伤组织要结合松散、颗粒较小且质地较硬，具有再生性(胚性)；

第二步是初步悬浮培养，接种后经过1个月左右悬浮培养获得一定量的小颗粒愈伤，继代时一般要用新鲜培养液置换一部分旧培养液，除了去除褐化愈伤组织外，一般不需要进行筛选，只在培养最后出现较多小颗粒愈伤时对其进行挑选；

第三步是悬浮愈伤的筛选驯化，由于初期培养挑选出来的小颗粒愈伤在继代时总是倾向于形成较大颗粒，需要在继代时持续选择小颗粒，此过程可持续长达7个月；

最后一步是建成悬浮细胞系的维持培养，在获得分散性良好的悬浮细胞系后，在继代过程中需要不时去除大颗粒细胞团，维持细胞系的分散性不变。

在后续过程需要植株再生的悬浮细胞培养试验中，悬浮细胞系本身的胚性以及从其衍生的再生植株的遗传稳定性对于多数研究而言都比较重要。一般而论，悬浮细胞系经历的培养时间越长，胚性越低，衍生的再生植株出现无性系变异特别是不育的概率也越大，因此缩短悬浮培养时间对于提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异至关重要。而在水稻中，通过现有方法构建悬浮细胞系因品种及方法不同一般需要6-8个月，最少也需要4-5个月，如此长的过程往往导致获得的悬浮细胞系再生性不高，而且无性系变异特别是不育性状出现的概率也较大。基于此，在水稻悬浮细胞培养中应寻找缩短悬浮培养进程的方法，从而提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。

向太和等人发现悬浮培养初期培养基变得比较浑浊的品种容易建成悬浮细胞系，稍微浑浊的品种较难建成悬浮细胞系，而完全澄清的品种无法建成悬浮细胞系，通过镜检发现，培养基变得浑浊是由于从愈伤组织上脱落下大量的细胞所致，因此这些研究者认为悬浮培养初期培养液是否浑浊是悬浮细胞系能否成功建成的重要标志[向太和,杨剑波,吴家道.安徽农业科学,1996,24(1):1-8]。

发明内容

本发明针对水稻现有悬浮细胞培养程序历时较长的问题，提供了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，可以缩短悬浮细胞培养进程，从而提高悬浮细胞系的胚性和减少无性系变异。本发明受启示于背景技术中向太和等人的研究发现，从愈伤组织上脱落的细胞(或小细胞团)最终发育成了我们所需要的小颗粒悬浮细胞团。因此，本申请的发明人通过初期培养时收集脱落细胞进行继代培养从而获得小颗粒细胞团。试验证明，此种操作的确能获得小颗粒细胞团而且还可以加速悬浮细胞系的建立进程。

本发明公开了一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)接种用胚性愈伤组织的获得；

(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；

(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；