[发明专利]一种建立水稻悬浮细胞系的方法及其制备工艺

权利要求书

1.一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)接种用胚性愈伤组织的获得；

(2)将获得的水稻胚性愈伤组织接种于培养基中，在摇床中振荡培养；

(3)将培养物中的大颗粒愈伤筛除，收集悬浮液，离心，收集沉淀物；

(4)添加新鲜培养基，将收集的沉淀物悬浮培养，悬浮培养过程中间隔不断添加新鲜培养基，继代培养多次后，直至培养基底部小颗粒细胞团大量产生，同时培养液变得较澄清；

(5)吸取培养液中的小颗粒进行继代培养，添加培养基，继续悬浮培养，继代2次后，转入不同培养基中继代，吸取其中小颗粒继代培养数次，即获得水稻悬浮细胞系。

2.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(1)中以Kasalath成熟种子为外植体进行愈伤组织诱导。

3.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中具体操作为：将3-5g水稻胚性愈伤组织接种于30ml培养基中，25-30℃条件下，以80-110转每分钟的转速在摇床中振荡培养。

4.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养基为NBL液体培养基。

5.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养物在悬浮培养后培养液变得浑浊时，过40目细胞筛筛除大颗粒愈伤，收集悬浮液，离心5分钟，收集沉淀物。

6.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(4)中具体操作包括：

(41)保留部分旧培养基，添加相同成分新鲜培养基，将步骤(3)中收集的沉淀物悬浮，悬浮培养条件和温度与步骤(2)相同，继代培养4次后，当培养液底部出现较多愈伤时，进行下一步操作；

(42)无需离心直接移除部分旧培养液，加入等体积新鲜培养液，培养条件不变，继续悬浮培养，相同方法继代2次，直至培养基底部小颗粒细胞团(直径1mm以下)大量产生，同时培养液变得较澄清。

7.根据权利要求6所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(41)中继代时需要1000rpm离心5min收集悬浮物，并保留旧培养基10ml，添加相同成分新鲜培养基20ml。

8.根据权利要求6所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(42)中移除20ml旧培养基，加入等体积相同成分新鲜培养基。

9.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(5)中用巴氏吸管吸取其中小颗粒(直径1mm以下)进行继代培养。

10.根据权利要求1所述的一种建立水稻悬浮细胞系的方法，其特征在于，所述步骤(5)中按照旧培养基：新培养基比例为1：2添加新鲜培养基，每次吸取其中小颗粒继代(直径1mm以下)，在继代培养40天左右，多数细胞团直径在0.5mm以下时即获得水稻悬浮细胞系。