[发明专利]双重标记磁珠及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种双重标记磁珠及其制备方法和应用。该双重标记磁珠在醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠表面固定有捕获抗体和固定寡核苷酸片段，在检测时，当捕获抗体捕获有目标微生物时，可以产生第一重信号。该第一重信号的有无可以反映出磁珠通过特异性的捕获抗体有无捕获到微生物。后续进一步可以通过特异性设计的第二扩增引物对对捕获的微生物的特异性核酸区域进行扩增，并借助第二荧光检测探针检测得到第二重信号，该第二重信号的有无即可反映由捕获抗体捕获的微生物是否是目的微生物。通过双重信号进行微生物检测，检测结果的准确性和可靠性显著提高，并且在检测时，首先经由捕获抗体捕获和富集目的微生物，因而检测灵敏度也显著提高。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种双重标记磁珠及其制备方和应用。

背景技术

1947年，Dick G W等在非洲乌干达的恒河猴体内发现了一种全新的黄病毒，并将之命名为寨卡病毒(Zika virus)。五年后，同样在乌干达报道了人类首例临床病例。在随后的50多年时间里，有报道的寨卡病例仅局限在非洲和亚洲地区，且只呈散发流行。直到2007年，在雅浦群岛暴发了寨卡病毒大规模流行，总共约73％的人口受到了感染，其中18％的人口有临床症状产生。自此以后，寨卡疫情有向全球蔓延的趋势，近两年在美洲和东南亚暴发的寨卡疫情充分验证了这一点。目前为止，全球已有67个国家和地区报道了寨卡病例，一百多万人口遭受了寨卡病毒的感染。WHO宣布寨卡病毒疫情已构成国际关注的突发公共卫生事件，并且称聚集性婴儿小头病例和某些神经系统混乱疾病如格林－巴利综合症与寨卡病毒有关联。

对寨卡病毒的早期诊断有助于有效遏制疾病的传播，目前针对寨卡病毒检测主要方法包括寨卡病毒血清学检测以及RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法对病毒核酸进行检测。但无论是血清学检测还是核酸检测法，一般只能产生单个检测信号，也即都是单信号检测，由于病毒复杂的特性，如会与其他病毒产生交叉反应等，单信号检测往往会导致假阳性或假阴性的结果，影响检测结果的准确性和可靠性。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够提高病毒检测结果的准确性和可靠性的双重标记磁珠及其制备方法和应用。

一种双重标记磁珠，包括醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠以及固定在所述纳米氧化铁磁珠表面的捕获抗体和固定寡核苷酸片段，所述捕获抗体通过其端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定，所述固定寡核苷酸片段通过其5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定。

在其中一个实施例中，所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠是四氧化三铁和γ氧化亚铁的混合纳米粒子构成的，其中，Fe²⁺和Fe³⁺的浓度之和为0.03mol/L～1mol/L，优选为0.09mol/L，Fe³⁺与Fe²⁺的摩尔比为(0.25～4):1，优选为2:1，Fe²⁺和Fe³⁺的物质的量之和与醛基葡聚糖的物质的量的比例为1:(2～12)，优选为1:10。

在其中一个实施例中，所述捕获抗体是兔抗寨卡病毒特异性多克隆抗体，分子量为165kDa，具有特异性识别寨卡病毒的位点。所述捕获抗体与所述醛基包被的纳米氧化铁磁珠的质量比为(5～100):1。

在其中一个实施例中，所述固定寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示，所述固定寡核苷酸片段与固定有所述捕获抗体的纳米氧化铁磁珠的质量比为1:(6.25～50)。

在其中一个实施例中，所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠的粒径为50nm±15nm，优选为50±10nm，更优选为50nm。

一种检测试剂盒，包括上述任一实施例所述的双重标记磁珠，还包括第一扩增引物对、第一荧光检测探针以及游离寡核苷酸片段；