[发明专利]双重标记磁珠及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测试剂盒，其特征在于，包括双重标记磁珠、第一扩增引物对、第一荧光检测探针以及游离寡核苷酸片段；

所述双重标记磁珠，包括醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠以及固定在所述纳米氧化铁磁珠表面的捕获抗体和固定寡核苷酸片段，所述捕获抗体通过其端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定，所述固定寡核苷酸片段通过其5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定；

所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠是通过将8.0g分子量为40kDa的羟基葡聚糖溶解到100mL去离子水中，通氮除氧10min后，加入1.62g FeCl₃·6H₂O和0.62g FeCl₂·4H₂O，1000rpm搅拌50℃水浴加热10min，加入浓氨水调节酸碱度至pH为10，将温度升至70℃保温继续反应1h后冷却，3000rpm离心5min将溶液中大颗粒离心去除，用盐酸调节酸碱度至中性，然后用0.22μm亲水性滤膜过滤，将滤液进一步除杂去除游离的羟基葡聚糖，形成羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠，所述羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠再与高碘酸钠按质量比为1:1反应后得到；

所述捕获抗体是兔抗寨卡病毒特异性多克隆抗体，分子量为165kDa，具有特异性识别寨卡病毒的位点；

所述固定寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述第一扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

所述第一荧光检测探针的序列如SEQ ID NO:4所示；

所述游离寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括第二扩增引物和第二荧光检测探针，所述第二扩增引物用于扩增所述捕获抗体捕获的寨卡病毒中的特异性核酸片段，所述第二荧光检测探针用于检测由所述第二扩增引物扩增的特异性核酸片段。

3.如权利要求1~2中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括结合或除杂缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、结合抗体蛋白层析柱、阳性参考品、阴性参考品以及PCR反应液中的至少一种。

4.一种如权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述双重标记磁珠、所述第一扩增引物对、所述第一荧光检测探针以及所述游离寡核苷酸片段制成所述检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述双重标记磁珠的制备步骤包括：

向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入捕获抗体，振荡反应，使所述捕获抗体的端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述捕获抗体固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液；向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入固定寡核苷酸片段，所述固定寡核苷酸片段的5’端修饰有氨基，振荡反应，使所述固定寡核苷酸片段5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述固定寡核苷酸片段固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到所述双重标记磁珠。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入捕获抗体时，按照所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠与捕获抗体的质量比为15:1的比例添加。

7.如权利要求5所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入固定寡核苷酸片段时，按照所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠与固定寡核苷酸片段的质量比为10:1的比例添加。