[发明专利]一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法，所述方法是将毕赤酵母中的GCW19基因敲除，本发明可以高效地获得具有甲醇耐受显著增加的毕赤酵母工程菌株gcw19Δ。与传统毕赤酵母菌株相比，本发明的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇为唯一碳源的培养基中该菌株生长速率明显提高。本发明方法获得的毕赤酵母工程菌株促进酵母细胞在甲醇中的快速生长，为实现利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高附加值化学品提供了良好的宿主菌株，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法。

背景技术

随着当今世界石油资源的日益减少和甲醇单位成本的降低，用甲醇作为新的石化原料来源已经成为一种趋势。但是近年来我国甲醇工业发展十分迅猛，大量的甲醇急需下游产品的消化。在传统下游应用，包括塑料、合成纤维、合成橡胶、胶粘剂、染料、涂料、香料、医药和农药等方面有着重要的作用。随着煤化工国产化工艺技术及装备大型化取得突破，醇醚燃料、甲醇制烯烃芳烃等新兴煤化工产业发展前景乐观。另外，基于国际石油价格上涨和中国汽油消费量大幅增加的发展趋势，甲醇汽油、甲醇燃料和二甲醚等新型燃料的优越品质逐渐引起了人们的重视，世界各国也相继研发了不同掺和比例的甲醇汽油，成为甲醇新的消费增长点。

除了替代传统的石化资源，利用甲醇作为碳源来生产蛋白也受到广泛的研究和关注。1969年，Kiochi Ogata等人首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，这种嗜甲醇酵母立刻引起人们极大的兴趣。此后通过这种酵母在甲醇为主要基质培养基上发酵生成单细胞菌体，作为一种单细胞蛋白推向市场作为高蛋白的动物饲料。在生产中，原料甲醇的成本占总成本的50％以上，加之近几年蛋白质饲料日益短缺，所以无论从甲醇下游产品开发，还是从饲料工业的需求角度分析，甲醇蛋白都是一只十分重要且极具市场潜力和发展前景的产品。

除了生产单细胞蛋白，这种嗜甲醇的菌株可以用于外源蛋白的表达。目前应用最广泛的巴斯德毕赤酵母受体是由Cregg于1985年建立的菌株GS115。这种细胞内含有甲醇代谢途径所必需的酶，如乙醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中乙醇氧化酶是甲醇代谢途径中的十分重要的酶，也是催化甲醇代谢第一步反应的酶，它能使甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢，过氧化氢酶又降解过氧化氢为氧气和水，过氧化氢又进一步氧化甲醛为甲酸和CO2，这样通过两种脱氢酶的作用使细胞以甲醇为唯一碳源。由于乙醇氧化酶与氧的亲合力低，所以在以甲醇为唯一碳源时，会代偿性产生大量的乙醇氧化酶，约占全部可溶性蛋白质的30％，而在以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到乙醇氧化酶，这说明乙醇氧化酶基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。一般来说，毕赤酵母在表达外源蛋白的大规模高密度发酵过程中，主要分为两个阶段，即菌体生长增殖阶段和诱导外源蛋白表达阶段。第一个阶段是酵母细胞营养生长阶段，菌体快速积累达到一定的菌体量需要价格低廉且能使酵母细胞生长迅速的碳源，通常为甘油和葡萄糖，而葡萄糖易产生葡萄糖效应，因而多用甘油作为唯一碳源。第二个阶段的外源蛋白表达是以甲醇作为唯一碳源进行诱导。在这个过程中，甲醇的精确流加是确定外源蛋白表达的关键，流加速率过低时细胞的生长受到限制，且诱导外源蛋白表达的强度过低，流加速率过高超过了毕赤酵母对于甲醇的利用速率，就会在过程中积累高浓度的甲醇，甲醇代谢产生的大量甲醛及过氧化氢，对细胞的毒害作用包括抑制细胞的生长、甚至造成细胞的死亡和裂解，胞内蛋白酶大量释放并降解分泌表达的外源蛋白。因此，选育耐高浓度甲醇的毕赤酵母菌株是提高外源蛋白表达量的重要途径之一。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，通过将毕赤酵母的GCW19基因敲除，构建出甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株，从而提供毕赤酵母菌的甲醇耐受性，由此获得的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株能够以甲醇为唯一碳源或者在搞浓度甲醇培养基中快速生长并生产酶制剂和高附加值化学品。

为了达到上述技术效果，本发明提供了如下技术方案：