[发明专利]一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法是将毕赤酵母的GCW19基因敲除。

2.如权利要求1所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述毕赤酵母基因GCW19的核苷酸序列如SEQ NO:1所示。

3.如权利要求2所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，该方法中用于构建甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的出发菌株为巴斯德毕赤酵母GS115。

4.如权利要求3所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)GCW19基因敲除组件的构建：GCW19基因敲除是以毕赤酵母GS115基因组作为模板，在引物P5/P6和P7/P8作用下进行PCR扩增，分别获得基因GCW19上游和下游同源臂大约600bp的片段，而后以质粒pPICZαA-Cre为模板，在引物P3/P4作用下扩增两端带有lox71和lox66的Cre-ZeoR表达盒，所述引物序列为：

P5:GATTTGTAAACATCATCGCCAGG，

P6:AGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACTTAATGCGAGAGTTGCACCGAT，

P7:GGAGACATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGCTGGTCTCTTCGTCGCTATGTT，

P8:GCATGATGGTCAATTCGGCACTA，

P3:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGATCTAACATCCAAAGACG，

P4:TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCTCCAGCTTGCAAATTAA；

(2)GCW19基因敲除表达盒的构建：将成功扩增的上下游片段和Cre-ZeoR表达盒进行重叠延伸PCR，构建GCW19基因敲除表达盒GCW19-Cassette；

(3)GCW19基因缺失的毕赤酵母菌株构建：将成功构建的GCW19基因敲除表达盒转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过敲除表达盒两端的同源臂与敲除靶基因上下游片段的同源重组，将敲除靶基因替换掉；成功替换的菌株利用甲醇诱导Cre酶的表达，执行loxp71和loxp66位点间Cre-ZeoR基因片段的切除，实现GCW19基因的无痕敲除。

5.一种甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株，其特征在于，该甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株是通过如权利要求1-4中任意一项所述的方法构建而成。

6.如权利要求5中所述的甲醇高耐受毕赤酵母工程菌株在以甲醇作为唯一碳源生产酶制剂中的应用。