[发明专利]一种从石油污染土壤富集分离优势固氮菌的方法

说明书

本发明提供了一种从石油污染土壤富集分离优势固氮菌的方法，属于微生物分离培养技术领域。本发明方法包括以下步骤：(1)采集石油污染土壤，加葡萄糖诱导后，乙炔还原法测定样品固氮酶活性，选择固氮活性高或固氮菌量多的样品，制备悬浮液进行梯度稀释；(2)制备无氮固体培养基，在培养基融化状态分别加入不同稀释度的悬浮液，混匀后转移至厌氧管中制备薄层培养基，选用0‑2％氧浓度培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染土壤中富集的优势固氮菌。本发明利用碳氮比失衡及速效碳源的添加，激活并富集土著固氮菌，同时采用无氮培养基，0‑2％氧浓度培养，促进固氮酶的表达，从而获得石油土壤中优势固氮菌，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及微生物分离培养技术领域，特别是涉及一种从石油 污染土壤富集分离优势固氮菌的方法。

背景技术

生物固氮是指固氮微生物将大气中的氮气转化为可被生物体利 用的氮源过程，可分为共生固氮、联合固氮和自生固氮。自生固氮 菌通常在自然环境或培养基中独立生活就能够固定分子态氮，并将 其还原为氨。

固氮菌广泛的分布在自然界中，而针对油污土壤微生物的分析 表明，固氮菌的数量与土壤一定浓度石油污染存在正相关。随着土 壤石油污染浓度的升高，存在固氮酶活性的高表达和固氮菌的富集， 推测原因是由于石油在微生物降解过程中，会产生大量可利用的碳 源，氮源的缺乏促进固氮菌的富集，而优势固氮菌的存在对提高石 油降解效率具有重要作用，一些菌株即便是浓度较低也可以增加石 油降解能力。Ikechukwu等人将固氮菌(Azotobacter vinelandii)和 降解石油的假单胞菌(Pseudomonas sp)混合接种于污染土壤中，石 油烃降解率从23.2–44.45％提高到66.83-69.6％。从石油污染土壤中 分离固氮菌，尤其是优势固氮菌，将为石油污染土壤的生物治理提 供重要的菌株资源。然而石油中各成分的存在影响并抑制了包括固 氮菌在内的大多数微生物的生长，导致微生物的多样性降低，同时， 固氮过程的高耗能以及对氧需求的多样性，限制了从石油污染土壤 中分离获得优势的固氮菌。

传统方法中，主要是对原位固氮菌进行分离，常见的固氮菌分 离方法主要使用Ashby无氮培养基，通过将待分离样品梯度稀释后， 表面涂布于无氮培养基中，在30℃培养3-5天后，观察并筛选纯化 菌株。后续通过固氮酶结构基因nifH的扩增和序列分析，结合固氮 酶活性分析对其是否是固氮菌进行确定。通过人工添加速效碳源的 方法，为固氮菌合成固氮酶提供能量，同时模拟石油降解后期碳氮 比失衡，将促进优势固氮菌的富集，同时利用0-2％微好氧培养，可 以有效提高优势固氮菌的分离效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从石油污染土壤中富集分离优势固 氮菌的方法以克服现有技术的不足。

本发明首先提供一种改进了的无氮固体培养基，其1L的配方为： 葡萄糖20-50g；K₂HPO₄0.5-1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g；三价铁 柠檬酸盐【Fe(Ⅲ)-citrate】0.02-0.05g；NaMoO₄·2H₂O 0.001-0.76g； 琼脂粉8-15g；加水至1L；pH 7.0。

优选地，本发明的提供的无氮固体培养基，其1L的配方为： 葡萄糖25-40g；K₂HPO₄0.8-1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.15-0.2g；三价 铁柠檬酸盐0.03-0.05g；NaMoO₄·2H₂O0.001-0.05g；琼脂粉8-12g； 加水至1L；pH 7.0。