[发明专利]一种从石油污染土壤富集分离优势固氮菌的方法

权利要求书

1.一种从石油污染土壤分离固氮菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集石油污染土壤置于厌氧管中，加葡萄糖诱导后，选择固氮活性高的土壤样品，制备悬浮液进行梯度稀释；

(2)取无氮固体培养基，并在无氮固体培养基的融化状态分别加入固氮酶活性高的土壤样品的不同稀释度的悬浮液，同一个固体培养基仅加入一种稀释度的悬浮液；混匀后转移至厌氧管中，制备薄层培养基，静置培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染土壤中富集的优势固氮菌；

所述无氮固体培养基1L的配方为：葡萄糖30g；K₂HPO₄ 1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；NaMoO₄·2H₂O 0.001g；琼脂粉10g；加水至1L；

步骤(1)中葡萄糖添加的量为0.01-0.05g/土样g，诱导时间为2-7天；

步骤(2)中培养基融化状态是指50-55℃下培养基的融化状态；静置培养的条件为使用0-2％氧浓度进行培养，25-35℃培养2-4天。

2.权利要求1所述的方法分离得到的固氮菌的纯化方法，其特征在于，挑取无氮固体培养基中生长的菌落，采用GCMY培养基纯化，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10-30g；K₂HPO₄0.5-1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2g；FeSO₄·7H₂O 0.02-0.05g；CaCl₂·2H₂O0.05-0.1g；NaMoO₄·2H₂O 0.001-0.76g；酵母粉0.5-1g；水解酪蛋白0.5-1g；麦芽汁0.5-1g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。

3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述GCMY培养基的1L的配方为：葡萄糖10g；K₂HPO₄ 1.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；FeSO₄·7H₂O 0.05g；CaCl₂·2H₂O 0.1g；NaMoO₄·2H₂O0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g；加水至1L；pH 7.0。

4.一种分离厌氧固氮菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的方法分离得到固氮菌，挑取无氮固体培养基内生长的菌落，采用厌氧管滚管法进行纯化，得到厌氧固氮菌。