[发明专利]沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法

说明书

本发明涉及沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌O157的检测引物及方法。多重PCR检测引物包括5对引物，分别扩增O₁₅₇的rfbE、fliC、stx1基因，单增李斯特菌的hlyA基因，沙门菌的invA基因，序列详见序列表所示。使用上述检测引物对肠出血性大肠杆菌O₁₅₇、沙门菌、单增李斯特菌的DNA进行多重PCR检测，设置阳性对照和阴性对照、空白对照，所述PCR扩增条件为94℃变性5min，然后94℃预变性30s，48‑52℃退火45s，72℃延长45s，共扩增循环30‑35个循环，最后72℃延伸5min。本发明的肠出血性大肠杆菌O₁₅₇、沙门菌、单增李斯特菌多重PCR检测引物及检测方法具有特异、灵敏的优点，通过一步检测可以实现对肠出血性大肠杆菌O₁₅₇、沙门菌、单增李斯特菌的精准鉴定。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测技术，特别是涉及肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O₁₅₇的多重PCR检测引物及方法。

背景技术

肠炎沙门菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌O₁₅₇属于WHO认定的四大食源性致病菌之列，公共卫生和食品安全意义重大。

肠出血性大肠杆菌O₁₅₇是一种对人致病的大肠杆菌，以引起肠道出血为特点，症状包括腹痛、血性腹泻、败血症、严重胃肠炎等，严重者可并发溶血性尿毒综合症，引起急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板减少甚至死亡。潜伏期为1-10日，通常为48-72小时。O₁₅₇还是重要的人畜共患性和食源性致病菌。O₁₅₇主要寄生在牛、羊等家畜和其它反刍动物体内。人主要通过食用被人畜粪便污染的食物，如烹煮不彻底的肉馅制品或未经消毒的牛奶、受粪便污染的水和蔬菜等被感染。美国CDC调查表明，每年约有70000人感染肠出血性大肠杆菌病例。O₁₅₇：H₇主要见于婴幼儿，以爆发流行性为主，美国在1982、1984、1993年曾三次发生O₁₅₇:H₇的爆发性流行。日本曾在1996年爆发过波及9000多人的大流行。O₁₅₇的主要毒力因子有黏附因子(菌毛、外膜蛋白、紧密素等)、肠毒素(志贺毒素STX、溶血素、Ⅲ型分泌系统)等。

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种重要的人畜共患性致病菌和食源性致病菌。LM感染或通过食用污染LM的食品，能引起人和动物的脑膜炎、败血症、严重胃肠炎及孕妇流产等，死亡率高达30％～70％。常见于老人、孕妇或免疫缺陷的人群。LM在4℃能生长繁殖，因此又被成为“冰箱杀手”。2011年夏秋季美国科罗拉多州Jensen农场的甜瓜污染LM引起李斯特菌病的流行，造成146人发病，其中30例死亡。

沙门菌(Salmonella)是一种革兰氏阴性菌，菌体呈两端钝圆杆状结构，无芽孢结构，多数的沙门菌有菌毛结构，能够运动。人们对沙门菌普遍易感，沙门菌能够引起急性传染病，常在温度较高时的夏秋季节在整个家庭或者用膳团体但闻爆发性流行。多表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻及发热等临床征候群。沙门菌常常通过食物进行传播。大自然界中沙门菌常寄生于家禽家畜的肠腔内，所以屠宰、加工过程中肉类有可能感染该菌。沙门菌的致病性来自染色体上的毒力基因，少量的基因存在于质粒上。目前对毒力岛的研究主要是研究SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4和SPI-5这五个毒力岛，其中的SPI-2是沙门菌起致病作用的主要原因，其中包含invA、hut、fim、spv、hns等基因是主要的致病毒力因子。这些基因具有高特异性，常用来设计引物用于沙门菌的检测和鉴定。