[发明专利]一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法，其步骤为：以分别带有荧光标记基因Mcherry的与35S启动子的质粒为模板，分别扩增Mcherry与35S片段，再通过融合PCR将35S与Mcherry扩增成一个35S+Mcherry的大片段，经电泳、切胶回收目的条带35S+Mcherry；组装重组质粒PHCE‑35S+Mcherry，转化大肠杆菌感受态细胞后提取重组质粒，经PCR鉴定为阳性重组质粒后送样测序鉴定。本发明载体构建只需通过三步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的一种技术。通过将外源的DNA导入受体细胞染色体的特定位点上，从而特异地改造基因组，研究基因的功能。该技术可以对基因组中的靶位点进行缺失、敲入、核苷酸修正等操作。2013年，科学家第一次将CRISPR/Cas9应用到人类和小鼠细胞系中对基因进行敲除，随后人们在模式植物和其他农作物中也成功获得了应用，经过改造的CRISPR/Cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。相对于转基因技术，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、快捷、不需要巨大的资金投入、在遗传编辑之后不留下转基因的痕迹，无须引用外源基因，因而生物安全性高，不具有转基因争议。

Mcherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的红色荧光蛋白，常用于标记和示踪某些分子和细胞组分。本研究通过35S启动红色荧光标记基因Mcherry的表达，可实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选，从而提高基因编辑效率。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)设计35S-F、35S-R、Mcherry-F、Mcherry-R和测序引物：

(2)以分别带有荧光标记基因Mcherry的与35S启动子的质粒为模板，对Mcherry与35S片段进行PCR扩增；

(3)PHCE-Cas9质粒线性化；

(4)35S+Mcherry和PHCE-Cas9质粒重组；

(5)重组载体PHCE-35S+Mcherry转化；

(6)PHCE-35S+Mcherry质粒提取并送样测序，制备得到带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体。

可选地，所述的35S-F、35S-R、Mcherry-F、Mcherry-R和测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5所示。

可选地，所述的PCR扩增回收35S启动子和Mcherry基因具体为：

(2.1)第一轮PCR扩增和回收：以带有Mcherry质粒为模板，Mcherry-F和Mcherry-R为引物PCR扩增Mcherry基因；以带有35S质粒为模板，35S-F和35S-R为引物PCR扩增35S启动子基因；扩增结束后将PCR产物以120V电压跑电泳，待loading buffer中的指示剂分开距离适当后停止电泳，在紫外凝胶成像系统中观察条带大小并拍照记录，确定是目的条带后，割胶，回收目的基因；分别标记为“35S”和“Mcherry”。