[发明专利]一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法

权利要求书

1.一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计35S-F、35S-R、Mcherry-F、Mcherry-R和测序引物：

（2）以分别带有荧光标记基因Mcherry的与35S启动子的质粒为模板，对Mcherry与35S片段进行PCR扩增；

（3）PHCE-Cas9质粒线性化；

（4）35S+Mcherry和PHCE-Cas9质粒重组；

（5）重组载体PHCE-35S+Mcherry转化；

（6）PHCE-35S+Mcherry质粒提取并送样测序，制备得到带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的35S-F、35S-R、Mcherry-F、Mcherry-R和测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的PCR扩增回收35S启动子和Mcherry基因具体为：

（2.1）第一轮PCR扩增和回收：以带有Mcherry质粒为模板，Mcherry-F和Mcherry-R为引物PCR扩增Mcherry基因；以带有35S质粒为模板，35S-F和35S-R为引物PCR扩增35S启动子基因；扩增结束后将PCR产物以120V电压跑电泳，待loading buffer中的指示剂分开距离适当后停止电泳，在紫外凝胶成像系统中观察条带大小并拍照记录，确定是目的条带后，割胶，回收目的基因；分别标记为“35S”和“Mcherry”；

（2.2）第二轮PCR扩增和回收：以第一轮PCR回收的目的基因“35S”和“Mcherry”为模板，35S-F和Mcherry-R为引物进行重叠PCR；PCR完成后配胶跑电泳，在凝胶成像系统中观察条带大小，符合目的片段大小后割胶回收，命名为“35S+Mcherry”。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的第一轮PCR扩增的Mcherry基因的扩增体系为：PHCE-Mcherry质粒 1微升，Mcherry-F 1微升，Mcherry-R 1微升，PrimeSTAR max 25微升，ddH₂O 22微升，35S启动子基因的扩增体系为：PHCE-35S质粒 1微升，35S-F 1微升，35S-R 1微升，Prime STAR max 25微升，ddH₂O 22微升，所述的第二轮PCR扩增的扩增体系为：35S 1微升，Mcherry 1微升，35S–F 1微升，Mcherry-R 1微升，Prime STARmax 25微升，ddH₂O 22微升，第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的扩增程序为：94℃ 4min，40×（94℃ 30S，55℃ 30S, 72℃ 45S），72℃ 2min。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的PHCE-Cas9质粒线性化具体为：

（3.1）使用MfeⅠ酶切PHCE-Cas9质粒，使其线性化；

（3.2）将用MfeⅠ酶切开的PHCE-Cas9质粒同未酶切的PHCE-Cas9的质粒一起跑电泳，对比电泳条带大小，检测酶切是否完全。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述的MfeⅠ酶的酶切体系为：PHCE-Cas9质粒 3微升，缓冲液 2微升，MfeⅠ酶 0.4微升，ddH₂O 14.6微升。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的35S+Mcherry和PHCE-Cas9质粒重组具体为：将重叠PCR产物割胶回收后的目的片段“35S+Mcherry”与酶切完全的线性化PHCE-Cas9质粒进行重组，构建重组的“PHCE-35S+Mcherry”质粒；重组体系为：酶切后的PHCE- Cas9质粒0.3微升，35S+Mcherry 1.2微升，重组酶 3微升；重组反应条件为：50℃，60min。