[发明专利]一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法

说明书

本发明涉及包含SEQ ID NO.1～2所示引物对和SEQ ID NO.3所示探针的用于肺炎克雷伯菌检测的试剂盒，还涉及用于检测肺炎克雷伯菌的方法。本发明试剂盒及方法可以准确检测样品中的肺炎克雷伯菌，检测快速、简便，成本低廉，特异性和灵敏度高，应用前景良好。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒和方法。

背景技术

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae,KP)是一种革兰氏阴性杆菌，在健康人的呼吸道和肠道正常菌丛中、自然界水和谷物中都能分离到，是重要的条件致病菌之一。当人体抵抗力降低时，肺炎克雷伯杆菌可经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，引起典型的原发性肺炎，还能引起各种肺外感染，包括婴儿肠炎和脑膜炎、泌尿道感染及败血症等。此外，肺炎克雷伯杆菌也是造成无特定病原体动物(specificpathogen free animals,SPF)污染的主要微生物之一。当实验动物如大、小鼠，在机体免疫功能下降或处于应激状态时，常因感染肺炎克雷伯杆菌而影响其质量及干扰动物实验，甚至引起动物死亡而造成实验数据和经济上的损失，严重影响到教学及科学研究。因此，肺炎克雷伯菌的检测在临床诊断、食品安全和实验动物等检测中都有着相当重要的意义

国家标准(GB14926-2001)规定了实验动物微生物学检测方法，其中肺炎克雷伯杆菌是SPF级实验大、小鼠必须检测并排除的病原体之一。利用国标方法进行检测时需要采样、培养、染色、生化反应等多个实验步骤，要1-2天才能完成，而且步骤繁杂，工作量较大。为了能满足SPF级实验动物肺炎克雷伯杆菌快速、高通量检测的迫切要求，

公开号为CN102080127B申请公开了一种检测15种临床常见病原微生物的基因芯片，其中包括了检测肺炎克雷伯杆菌。但是该基因芯片方法有以下缺点：首先，它需要经过35个循环的PCR、2小时的预杂交、6小时的杂交以及多次清洗等，步骤繁琐，整个检测时间在10个小时以上；其次它需要特定的杂交仪、基因芯片检测仪等昂贵仪器，普适性不强。

普通PCR方法可以直接检测病原体核酸，但是一般都需要在PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳分析条带来判断结果，且灵敏度不高。基于Taqman探针的实时荧光定量PCR技术比普通PCR技术特异性更强，能实现定量分析，可以提高检测的可靠性，已在多个领域得到应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒和方法。

本发明提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对、SEQ ID NO.3所示的探针。

本发明还提供了SEQ ID NO.1～2所示的引物对和SEQ ID NO.3所示的探针在制备检测肺炎克雷伯杆菌的试剂中的用途。

其中，所述试剂是检测实验动物样品、食品、临床样品中的肺炎克雷伯杆菌的试剂。

本发明还提供了一种用于检测肺炎克雷伯杆菌的试剂盒，包括：DNA提取试剂、PCR反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、灭菌水，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，PCR反应液中用于信号监测的寡核苷酸探针为荧光探针，具体为在SEQ ID NO.3所示的探针的5’端加荧光基团、3’端加荧光淬灭基团。

本发明还提供了一种检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)提取样本DNA：取待检样本，用DNA提取试剂提取待检样本中的DNA；

(2)基因扩增：用权利要求5所述的试剂盒中的PCR反应液、酶混合液、灭菌水按比例混合，对待检样本中的DNA进行扩增，扩增程序为94℃1min；94℃5s，60℃10s收集荧光，进行50个循环；