[发明专利]一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建和应用，属于生物技术领域。是以茄子WRKY26基因的基因组DNA序列为参照，设计靶位点gRNA；构建靶位点gRNA和Cas9蛋白的表达盒；再将gRNA和Cas9蛋白的表达盒插入到双元表达载体pCAMBIA1301。将重组质粒转入农杆菌EHA105菌株中，并由EHA105介导转化茄子子叶，获得遗传转化植株，经PCR和测序验证确定突变株系。本发明以茄子SmWRKY26基因为例，快速简单高效率地对茄子基因进行了地定点突变。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种茄子CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法和应用。

背景技术

茄子是重要的茄科蔬菜之一。随着茄子基因组数据的公开，针对茄子基因功能的研究和茄子现代分子育种得到了快速发展。例如，病毒诱导的基因沉默、RNAi、过量表达等基因功能研究手段以及分子标记育种、转基因育种和分子设计育种为代表的现代分子育种手段在茄子研究中占据一定地位。但这些手段存在一些缺点：得到的材料不能稳定遗传，非定点敲除，育种周期长等。

基因组编辑技术已成为基因功能研究和精准的分子育种等重要手段。常用的基因组编辑技术主要包括锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced shore palindromicrepeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)。而在CRISPR/Cas系统中以Ⅱ型的CRISPR/Cas9系统应用最为常见。与ZFN和TALEN这两种编辑技术相比，CRISPR/Cas9具有如下几点优点：(1)操作简单，可直接通过RNA与靶序列的碱基互补完成；(2)靶位点的识别广泛，可识别切割甲基化位点；(3)灵活高效，可同时对多个靶位点进行编辑。因此，自2013年CRISPR/Cas9基因编辑技术的建立以来，CRISPR/Cas9已经被广泛应用于多种物种的基因和基因组编辑研究。其原理是在20nt长的碱基靶序列(gRNA)的引导下，完成靶位点的识别，然后Cas9核酸酶切割靶点双链，形成DNA双链断裂缺口(DSB)，激活细胞内的两种修复机制(即非同源末端连接或同源重组)，从而产生断口处碱基缺失、插入和替换。

CRISPR/Cas9编辑技术在植物中的应用主要集中在模式植物拟南芥、农作物水稻、小麦、棉花以及蔬菜作物番茄中。然而，到目前为止尚未见有关CRISPR/Cas9技术在与番茄同科的茄子上的应用报道。因此，本发明以茄子SmWRKY26基因为例，建立了茄子CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，为CRISPR/Cas9基因编辑技术在茄子中的应用奠定了坚实基础。

发明内容

技术问题

本发明所要解决的问题是：针对茄子基因功能研究和育种研究中存在的无法定点敲除基因、无法获得稳定的和无外源基因插入的突变体的问题，提供一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用。

技术方案

一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，包括：将含gRNA和Cas9蛋白的表达盒插入到pCAMBIA1301载体中产生敲除编辑载体和农杆菌介导的茄子遗传转化，其特征在于，gRNA靶位点设计在SmWRKY26基因5’端，序列为：P1:5’-ATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’；其反向互补序列P2:5’-GAACCAGTCCTCTCTGCAAT-3’；扩增靶位点对应的引物序列：P3:5’-GATTGATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’；

P4:5’-AAACGAACCAGTCCTCTCTGCAATC-3’。

具体包括以下步骤：