[发明专利]一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用

权利要求书

1.一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除植株的构建方法，包括：将含gRNA和Cas9蛋白的表达盒插入到pCAMBIA1301载体中产生敲除编辑载体和农杆菌介导的茄子遗传转化，其特征在于，gRNA靶位点设计在SmWRKY26基因5’端，序列为：P1:5’-ATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’；其反向互补序列P2:5’-GAACCAGTCCTCTCTGCAAT-3’；扩增靶位点对应的引物序列：

P3:5’-GATTGATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’；

P4:5’-AAACGAACCAGTCCTCTCTGCAATC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除植株的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)gRNA靶位点的选择

根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，把gRNA靶位点设计在登录号为Sme2.5_01585.1_g00006.1的SmWRKY26的5’端第一个外显子上，序列为

P1:5’-ATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’，

P2:5’-GAACCAGTCCTCTCTGCAAT-3’；

(2)gRNA的设计和退火

以SmWRKY26基因组DNA SEQ ID NO:1为参照，设计扩增gRNA的引物序列，序列如下：根据psgR-cas9-At载体经BbsI酶切后产生的粘性末端序列以及G为转录起始位点的原则，设计扩增靶位点对应的引物序列：

P3:5’-GATTGATTGCAGAGAGGACTGGTTC-3’，

P4:5’-AAACGAACCAGTCCTCTCTGCAATC-3’；

将P3和P4分别稀释到10μM，并各取5μl等体积混合，进行退火反应得到gRNA产物；

反应条件：95℃，5min；95℃(-1℃/cycle)，70cycles，1min；4℃保存；

(3)gRNA插入到psgR-cas9-At载体：

16℃过夜后，连接产物转化至大肠杆菌感受态，挑取单克隆，PCR并送样测序验证，得到中间载体即为包含gRNA和Cas9蛋白的表达盒，命名为pEA1；

(4)pEA1和pCAMBIA1301双酶切，37℃水浴3h后纯化酶切产物；pEA1和pCAMBIA1301的酶切产物分以5:1的摩尔比进行混合，加入1μl T4连接酶和1μl连接酶buffer，16℃过夜；连接产物转化至大肠杆菌感受态，挑取单克隆，PCR并送样测序验证，得到最终编辑载体命名为pEA2；酶切体系如下：

(5)遗传转化：将编辑载体pEA2电转化农杆菌EHA105感受态细胞，筛选阳性克隆；以茄子子叶为外植体进行遗传转化，经潮霉素抗性筛选，愈伤组织再生，获得遗传转化植株，并进行PCR和测序验证。