[发明专利]一种对鲑鳟鱼胚胎活体进行倍性鉴定的方法

说明书

一种对鲑鳟鱼胚胎活体进行倍性鉴定的方法，它涉及一种对鱼胚胎进行倍性鉴定的方法。本发明方法能够缩短倍性鉴定周期，避免养殖过程中外界因素导致的生产损失。鉴定方法：一、5～8℃条件下将鲑鳟鱼眼点期胚胎单独暂放，并保持胚胎空气交换不缺氧；二、制成胚胎细胞悬浊液；三、过滤，获得检测样本；四、将染色的已知鲑鳟鱼二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将检测样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小。

技术领域

本发明涉及一种对鱼胚胎进行倍性鉴定的方法。

背景技术

鱼类染色体操作技术(雌核发育和多倍体诱导)在水产动物育种领域发挥着重要作用。目前，国际上有关多倍体诱导的研究工作进展很快。在鲑鳟类、鲆鲽类、罗非鱼等海、淡水鱼类中诱导出三倍体，在鲑科鱼类中己获得了大西洋鲑、硬头鳟、虹鳟、细鳞大麻哈鱼、大鳞大麻哈鱼和美洲红点等同源三倍体。近年来国内也成功地诱导出了三倍体团头鲂、水晶彩鲫、真鲷、黑鲷、牙鲆和虹鳟，尤其在上世纪八十年代中期到九十年代初期，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所就开展了虹鳟全雌培育技术研究，并本世纪初完成了虹鳟三倍体制种技术研究，初步实现了三倍体的规模化生产；之后，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所还开展了三倍体山女鳟和三倍体金鳟制种技术的研究。

有关鱼类倍性鉴定方法有很多种，包括：染色体计数法、红细胞及细胞核体积测量法、核仁组织区银染计数法、体细胞DNA相对含量测定法等。染色体技术法需要获得鱼类体细胞有丝分裂中期分裂相(染色体核型)，通过对染色体进行配对，人工挑选出所有同源染色体，并进行计数，并与参考染色体组进行比较鉴定出鱼类的倍性的一种方法，该方法目前是公认的最准确的鱼类倍性鉴定方法，但由于存在有丝分裂中期分裂相制备成功率低与同源染色体配对人为判断存在误差几率高、一级步骤繁琐和专业性太强等特点，不适合进行大批量检测，尤其在生产实践中进行大批量多倍体筛选实用性不强。红细胞及细胞核体积测量法和核仁组织区银染计数法测定倍性准确性较低，且不易用于批量处理诱导多倍体后代的倍性鉴定。

在开展鱼类染色体加倍实验时，需要对所设定的实验条件进行有效评估，例如压力强度、压力效应时间以及受精后压力介入窗口期等；而且对于苗种创制企业在进行多倍体规模化制种生产中也要对制备的多倍体苗种进行倍性验证，都需要一套稳定、快速和便捷的倍性鉴定方法，尤其在胚胎阶段。因为多倍体苗种生产企业在卖出去苗种的同时要在第一时间知道倍性情况。目前，对鱼类雌核发育和多倍体诱导结果的评估都是等制种后代发育至幼鱼期之后再进行倍性鉴定，继而评估染色体操作实验所设定参数及条件的优劣。这样就存在一些缺陷：(1)由于雌核发育和多倍体诱导技术所获得的后代须等到进入幼鱼阶段才能进行倍性鉴定，尤其像鲑鳟鱼发育周期长，发育到幼鱼阶段需要6个月，这导致必须等很长时间才能评估染色体操作实验的结果；(2)由于评估倍性操作实验结果前，有较长一段养殖过程，在这个过程中因养殖环境变化、养殖技术及病害等原因造成鱼类的死亡也是不可预知，染色体操作实验制备的后代没等检测就全部死亡的案例也比比皆是。

发明内容

为了能够缩短倍性鉴定周期，避免养殖过程中外界因素导致的生产损失，本发明提供了一种对鲑鳟鱼胚胎活体进行倍性鉴定的方法。

本发明对鲑鳟鱼胚胎活体进行倍性鉴定的方法如下：

一、5～8℃条件下将鲑鳟鱼眼点期胚胎单独暂放，并保持胚胎空气交换不缺氧；

二、将鲑鳟鱼眼点期胚胎用尖头镊子刺穿，释放出卵内的液态油脂，之后用镊子夹住胚胎在PBS缓冲液中搅动清洗掉多余油脂，随后置于培养皿的细胞核染液中，将卵皮及活体胚胎切碎、摇匀制成胚胎细胞悬浊液；

三、用细胞核染液冲洗培养皿与步骤二胚胎细胞悬浊液混合，再用30μm孔径滤网对胚胎细胞混合悬浊液进行过滤；取滤液用30μm孔径滤网再过滤一次，获得检测样本；