[发明专利]一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法

说明书

本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种共表达L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法。针对现有的丙酮酸的合成方法中酶法转化法的成本较高而不适于工业化的问题，本发明的技术方案是：[1]构建L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体，转化到大肠杆菌中；[2]将步骤[1]得到大肠杆菌高密度发酵的获得L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达的大肠杆菌工程菌；[3]将步骤[2]得到的大肠杆菌工程菌的湿菌体投入L‑乳酸钠溶液中，通无菌空气搅拌转化，得到转化液；[4]将步骤[3]得到的转化液通过微虑超滤除去菌体及蛋白，通过除杂和醇沉得到丙酮酸钠。本发明适用于丙酮酸钠的工业生产。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法。

背景技术

丙酮酸，又叫焦葡萄糖酸，是三羧酸循环的起始底物，在生物体内广泛存在。在化工合成中，丙酮酸是非常重要的中间体，需求量非常大。丙酮酸是L-多巴、L-酪氨酸、L-色氨酸生物合成的前体，同时也是合成农药的初始底物。目前，丙酮酸生产主要采用化学合成法、发酵积累和酶转化法三种方法。

1、化学合成法是沿用1932年Howard和Fraser报道的通过酒石酸脱水脱羧生成丙酮酸，污染大、收率比较低(0.29～0.30g/g)，随着环评、产业升级等政策将逐步淘汰。

2、发酵积累法，是用光滑球拟酵母代谢葡萄糖积累丙酮酸，日本东丽株式会社于1988年选育出丙酮酸产量达50多克每升的光滑球拟酵母，使得工业化生产成为现实。最新专利CN201710012209.3中报道光滑球拟酵母经56小时培养，丙酮酸积累量达到89g/L。光滑球拟酵母代谢葡萄糖积累丙酮酸，发酵阶段成本低廉产量高，但提取回收工序复杂，后处理成本比较高。

3、酶法转化法，通常是利用乳酸氧化酶将乳酸氧化成丙酮酸与过氧化氢，在过氧化氢酶存在的条件下将过氧化氢及时清除。美国专利US4900668中利用醋酸杆菌(Acetobacter sp.80-M)将D-乳酸转化成丙酮酸，转化率很高，但由于D-乳酸价格较L-乳酸高，很难工业化生产。许平、马翠卿等发现不依赖NADH的乳酸脱氢酶，反应过程中不产生过氧化氢，用DL-乳酸钠作唯一碳源培养不动杆菌或施氏假单胞菌，得到菌体转化DL-乳酸钠转化约0.48M丙酮酸钠，比较有应用价值，但产量偏低；Amy Eisenberg等1996年报道，用毕赤酵母共表达源于甜菜的乙醇酸氧化酶和内源的过氧化氢酶，无缓冲液、不控制pH在5℃的温度下转化1M L-乳酸钠底物，转化率达到94％，产量很高，但是反应温度低制冷能耗大，且杂质醋酸钠较难分离。

发明内容

针对现有的丙酮酸的合成方法中酶法转化法的成本较高或产量偏低而不适于工业化的问题，本发明提供一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，其目的在于：采用价格低廉的原料、实现高产量的生产，同时降低后处理成本，从而适合工业化大生产。

本发明采用的技术方案如下：

一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，包括如下步骤：

[1]构建L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体，转化到大肠杆菌中；

[2]将步骤[1]得到的大肠杆菌进行高密度发酵；

[3]将步骤[2]高密度发酵后的大肠杆菌的湿菌体投入L-乳酸钠溶液中，通无菌空气搅拌转化，得到转化液；

[4]除去步骤[3]得到的转化液中的菌体及蛋白，通过除杂和醇沉得到丙酮酸钠。

本发明中，共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶转化L-乳酸钠生产丙酮酸钠的原理如下：