[发明专利]一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法

权利要求书

1.一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，其特征在于，包括如下步骤：

[1]构建L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体，转化到大肠杆菌中；

[2]将步骤[1]得到的大肠杆菌进行高密度发酵；

[3]将步骤[2]高密度发酵后的大肠杆菌的湿菌体投入L-乳酸钠溶液中，通无菌空气搅拌转化，得到转化液；

[4]除去步骤[3]得到的转化液中的菌体及蛋白，通过除杂和醇沉得到丙酮酸钠。

2.按照权利要求1所述的一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，其特征在于，所述步骤[1]具体包括如下步骤：

[1-1]扩增来自大肠杆菌DH5α的黄素单核苷酸依赖型的L-乳酸氧化酶基因；

[1-2]将步骤[1-1]得到的L-乳酸氧化酶基因与T载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，提取质粒得到L-乳酸氧化酶基因与T载体连接构成的T-lox载体；

[1-3]合成短小芽孢杆菌过氧化氢酶基因序列，克隆构建过氧化氢酶基因与pUC57载体连接构成的pUC57-CAT载体；

[1-4]将步骤[1-2]得到的T-lox载体用NdeI和BglII双酶切，回收包含L-乳酸氧化酶基因的基因片段；将步骤[1-3]得到的pUC57-CAT载体用BglII和XhoI双酶切，回收包含过氧化氢酶基因的基因片段；将包含L-乳酸氧化酶基因的基因片段、包含过氧化氢酶基因的基因片段和经NdeI、XhoI双酶切的pET32a骨架用T4连接酶连接，将连接产物转化到DH5α感受态细胞中；培养DH5α感受态细胞并提取质粒获得L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体；

[1-5]将步骤[1-4]得到的共表达载体转化到大肠杆菌中。

3.按照权利要求1所述的一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，其特征在于，所述步骤[2]具体为：

在无菌环境下移种步骤[1]得到的大肠杆菌于一级培养基中，培养9h至OD600达到3～4后，将一级培养基中的大肠杆菌转接到二级培养基中培养4～5h；最后接入发酵罐中培养至OD600达到22～28，加入诱导剂继续培养12h放罐，得到大肠杆菌工程菌。

4.按照权利要求1所述的一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法，其特征在于，所述步骤[3]具体包括如下步骤：

[3-1]将步骤[2]得到的大肠杆菌工程菌的湿菌体加入0.4体积水并加入转化罐中；

[3-2]配置L-乳酸钠溶液，称取L-乳酸加水稀释，并用NaOH反应生成L-乳酸钠，添加EDTA二钠，调节pH＝7～8定容至0.6体积；

[3-3]将步骤[3-2]配置的L-乳酸钠溶液加入0.6体积至转化罐中，通无菌空气，高速搅拌，控制pH＝6.5～9，温度控制25～37℃，待溶氧DO值升至100％，转化完毕。