[发明专利]一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种夜来香花叶病毒TC‑RT‑nested‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的夜来香花叶病毒检测试剂盒包括病毒抽提缓冲液、PBST缓冲液、外侧正向引物、外侧反向引物、内侧正向引物、内侧反向引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、dNTPs、PCR Mix、阳性对照和阴性对照。本发明根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计2对特异性引物，采用TC‑RT‑nested PCR技术对夜来香花叶病毒进行检测。本发明的检测方法无需RNA提取步骤，具有操作简便、成本低、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。

技术领域

本发明涉及一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于农业生产及进出境口岸上夜来香花叶病毒的快速检测和监测。

背景技术

西番莲(Passiflora edulia Sims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(passiflora)多年生草质藤本植物，原产南美的巴西、阿根廷，广泛分布于热带、亚热带地区，我国主要分布在台湾、广东、福建、广西、浙江、四川等地区。西番莲作为一种高级天然饮料作物，在栽培生产过程中，常常受到病虫害的危害，其中病毒病是西番莲生产上的第二大病害，严重影响西番莲的产量和品质，在巴西、澳大利亚、秘鲁、肯尼亚及我国台湾地区已成为限制西番莲生产发展的重要因素。迄今为止，国内外报道能够侵染西番莲的病毒主要包括西番莲病毒科(Potyviridae)西番莲Y病毒属(Potyvirus)、雀麦花叶病毒科(Bramovirida)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)、柑橘粗糙病毒属(Cilevirus)、乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、豇豆花叶病毒科(Comovirinae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)病毒等。其中，夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)是近年来西番莲上新报道的一种马铃薯Y病毒属病毒，基因组具有典型的Potyvirus结构特征，正义ssRNA，全长9689nts，编码一个长的聚合蛋白。夜来香花叶病毒的病毒粒体呈线状，长约750nm，宽约12nm。夜来香花叶病毒侵染寄主植物主要引起花叶症状，在越南夜来香、泰国西番莲、印度尼西亚广霍香上已有发生危害的报道，该病毒可通过机械接种传播，但是否通过蚜虫传播尚未明确。由于西番莲在生产上常采用扦插、嫁接育苗，因此夜来香花叶病毒可能通过上述途径大面积或远距离传播。

近年来，随着国内外对西番莲需求的不断增长，我国的西番莲种植面积逐渐增大，病毒病随之发生、传播和扩散的风险也越来越高。为预防与控制西番莲病毒病，加强病毒的早期检测，明确病毒发生的种类，对于及时制定有效的防治措施，保护西番莲生产安全具有重要意义。鉴别寄主鉴定、电子显微镜观察、血清学检测、RT-PCR是植物病毒检测诊断的常用方法。利用鉴别寄主鉴定方法需要隔离种植的指示植物，结果虽直观，但易受环境条件的影响；电子显微镜观察需要昂贵的仪器，并对操作的专业技术人员具有较高的要求；血清学酶联免疫吸附测定方法的灵敏度相对较低，检测结果容易出现假阴性。基于核酸水平的分子生物学方法检测植物病毒，具有特异性强、灵敏度高和时间快的显著优点，但该方法在夜来香花叶病毒上应用的研究报道极少。关于TC-RT-nested PCR(试管捕捉巢式RT-PCR)技术检测夜来香花叶病毒，国内外至今尚未有报道，更未见专门用于夜来香花叶病毒检测的TC-RT-nested PCR检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速、准确地检测农业生产及进出境口岸上的夜来香花叶病毒。为了解决上述技术问题，本发明克服了现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种夜来香花叶病毒的TC-RT-nested PCR检测试剂盒及其检测方法，以满足农业生产及进出境口岸检疫的需要。