[发明专利]一种高表达的耐热酸性木聚糖酶基因及其表达载体和应用

说明书

本发明公开了一种高表达的耐热酸性木聚糖酶基因及其表达载体和应用。对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的耐热酸性木聚糖酶基因XynZN进行改造后得到适宜在毕赤酵母中表达的优化耐热酸性木聚糖酶基因XynZNOp。本发明进一步构建了重组毕赤酵母组成型和诱导型载体并将其转化到毕赤酵母中筛选得到高效表达耐热酸性木聚糖酶的重组菌株，结果显示在重组菌株中XynZNOp基因相对于野生型的XynZN基因表达量有着显著提高，在组成型和诱导型重组菌株中提高幅度分别为52.0％和46.3％。使用本发明耐热酸性木聚糖酶XynZNOp优化基因序列构建的毕赤酵母重组菌株，目的蛋白表达量显著提高，极大的降低了耐热酸性木聚糖酶的生产成本，为其工业化扩大生产应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及到耐热酸性木聚糖酶的基因优化序列以及含有优化序列的重组表达载体和重组宿主细胞，本发明进一步涉及它们在生产耐热酸性木聚糖酶中的应用。

背景技术

木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，为植物细胞壁中半纤维素的主要组分，占植物细胞干重的30％，是一种丰富的生物多糖资源，在自然界中含量仅次于纤维素。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中的一种关键酶，它以内切的方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键，其水解产物有木寡糖，也有少量木糖和阿拉伯糖等单糖。

现今木聚糖酶已成功应用于饲料、食品、医药、造纸等工业中。例如：木聚糖酶较早应用于饲料行业中，因木聚糖是饲料中的典型抗营养因子，由于木聚糖的持水性、小分子吸附和表面活性，如果饲料中含有较多的木聚糖会对单胃或无胃动物形成抗营养作用，尤其是大麦、小麦、麸皮和米糠等木聚糖含量很高的饲料更加突出。在这类高木聚糖含量饲料中添加木聚糖酶可以有效解除木聚糖的抗营养作用。其对木聚糖抗营养作用的解除机制主要有：破坏植物细胞壁结构，促进饲料营养成分的释放；降低胃肠道食糜粘度，提高养分的吸收和转化效率；促进动物内源性消化酶的分泌，使饲料的表观代谢能得以增加；改善胃肠道的微生态环境。

在饲料制粒过程中需要经历短暂的高温处理，另外家畜家禽类动物胃肠道是偏酸性环境，本发明涉及的木聚糖酶既能经历高温处理而保持较高残留酶活，又能在偏酸性的动物消化道内体现较高的催化活力，因此特别适合在饲料工业使用，具有很好的应用前景。

木聚糖酶产业发展现阶段必须克服的问题是怎样降低它的生产成本提高它的产量。为解决这个问题，人们尝试通过诱变野生菌选育高产菌、利用基因工程手段构建重组工程菌、培养条件的优化等等一些列手段来提高木聚糖酶的产量。

目前，我国各企业使用的优良木聚糖酶生产菌株依然依赖于国外技术，难以实现核心技术的国产化，使企业的生产成本增加。随着我国畜牧业的现代化水平越来越高，动物营养越来越受到重视、作为重要的饲料添加剂、木聚糖酶的需求也越来越大，尤其是对于产量高、热稳定性好、性质优良以及酶活性高的木聚糖酶制剂的需求也越来越大。随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术已对来源于微生物的多种木聚糖酶基因进行了克隆测序，对木聚糖酶基因的结构、功能以及调控表达等方面有了较为深入的了解。随着分子生物学技术的深入研究，利用一些高效微生物菌株来生产优良性质的木聚糖酶已经成为一种新的有效途径。各国研究专家已经从各种不同微生物中筛选出了大量的具有优良性质的木聚糖酶基因，这些木聚糖酶拥有不同的性质，如高比活、耐热、耐低温、耐酸等。为了提高这些木聚糖酶的生产水平，有研究者将这些木聚糖酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等宿主菌中进行异源重组表达。研究显示，对于真菌来源的木聚糖酶，毕赤酵母作为真核细胞宿主对表达蛋白能够进行糖基化修饰，因此是真菌来源木聚糖酶理想的异源表达宿主。来源于黑曲霉的木聚糖酶耐热性较好，并且在酸性环境下有较高活力，对耐热酸性木聚糖酶进行优化改造，得到能在毕赤酵母中分泌表达量有显著提高的木聚糖酶优化基因，具有巨大的应用价值。

发明内容

本发明目的之一是提供一种经过优化改造的高表达的耐热酸性木聚糖酶基因序列，该耐热酸性木聚糖酶优化基因在宿主细胞中，尤其是毕赤酵母宿主细胞中的分泌表达量高。