[发明专利]一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发相关标记代谢物的方法

说明书

本发明涉及一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物的方法，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，用解剖刀分离未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶、NMR检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选。本发明通过对粗枝云杉体胚不同组织样品的代谢组研究，建立了一套高效、快速和重复性好的粗枝云杉体胚代谢组样品前处理、提取、数据处理和差异代谢物筛选的方法，能有效地揭示和评价干化处理影响粗枝云杉体胚从形态学成熟转向生理学成熟的相关代谢信息。

技术领域

本发明涉及组织培养环节的培养技术、仪器分析技术和数据分析技术领域，具体地说，涉及NMR技术评价干化对粗枝云杉体胚萌发影响的方法。

背景技术

代谢组学是一种通过分析生物发育过程中的大量代谢物，并研究它们在不同生理和遗传条件下的浓度差异，进而辅助基因表达和蛋白定量的新技术。任何环境胁迫、病理及其它因素对植物生命系统的影响均会引起植物体内代谢物的浓度或代谢流发生变化，而且大多数代谢途径不是孤立存在的，因此代谢组学作为反映某一植物生命过程中整体水平的代谢物质动态变化过程，正在广泛应用于植物功能基因组学、分子表型、分子病理学等领域的研究。

粗枝云杉(Picea asperata Mast.)是松科云杉属植物，我国特有树种，分布范围广、材质优良且适应性强。它不仅是重要的用材树种，也是川西高原、甘肃南部和陕西西南部等高山地区森林演替的顶极群落和地带性植被的建群种。目前，粗枝云杉的体细胞胚胎发生技术已基本建立，但其中一些关键环节的内在调控机理还未知，尤其是萌发前体胚内部物质的改变和积累对体胚萌发的作用。

干化是体胚萌发前的一种处理方式，能促进体胚的萌发。研究表明，干化主要是使体胚由“形态学”成熟转化为“生理学”成熟，待转入萌发培养基后能获得一个较高的萌发率。目前，对干化促进体胚萌发的分子机理尚不清楚。基于粗枝云杉干化处理前后子叶和胚根代谢组结果分析，对揭示干化的作用机理和发现潜在的标记代谢物均具有重要的意义。但是，目前有关云杉体胚干化处理前后代谢组学的研究国内外尚无报道，尤其是基于NMR技术对云杉代谢组检测的样品处理、提取、数据分析和标记代谢物筛选缺乏可靠的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于NMR技术对粗枝云杉体胚代谢组进行测定和分析，并用来评价干化处理对粗枝云杉体胚萌发能力影响的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物的方法，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，切取未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶、NMR检测，代谢组数据分析和标记代谢物的筛选。

根据本发明的方法，所述干化处理方法为：将粗枝云杉分化成熟的体细胞胚置于滤纸上，然后在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m²·s的光照强度条件下培养7-14天，得到干化后的体胚。

进一步的，所述干化处理方法具体为：将分化成熟的体胚平铺在1-4层滤纸上，再把带有体胚的滤纸放入小培养皿(35mm)中，每个小培养皿分散放置30-40个胚，然后将不带盖的小培养皿放入大培养皿(90mm)中，最后在大培养皿中加入10mL无菌水(不超过小培养皿三分之二的高度)，加盖密封。在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m²·s的光照强度条件下，处理7-14天。

其中，所述的“滤纸法”干化处理中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数优选为2-3层，更优选为2层；光照强度优选为15μmol/m²·s；干化处理时间优选为14天。

根据本发明的方法，所述分离步骤包括在体视显微镜下切下干化处理后体胚的子叶和胚根，同时切取未干化体胚的子叶和胚根；将切取的目标组织置于冷冻管中，冷冻保存。