[发明专利]一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发相关标记代谢物的方法

权利要求书

1.一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物方法，其特征在于，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，分离未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶，NMR检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选；

其中，所述干化处理方法为：将粗枝云杉分化成熟的体细胞胚置于滤纸上，然后在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m²·s的光照强度条件下培养7-14天，得到干化后的体胚；

所述分离步骤包括在体视显微镜下切下干化处理后体胚的子叶和胚根，同时切取未干化体胚的子叶和胚根；将切取的目标组织置于冷冻管中，冷冻保存；

所述体胚组织代谢物的萃取方法为：向低温研磨后的样品中加入50％(v/v)的甲醇溶液作为提取剂，在93μm振幅条件下进行超声波萃取，4秒超声，3秒间歇，共循环16次；离心后取上清液于离心管中并用氮气吹干；

所述冻干及复溶方法包括：向冻干的样品中加入纯水，涡旋后加入ACDSS试剂，再次涡旋混匀后，离心取上清液，作为NMR检测的提取液；

所述代谢组数据处理方法具体如下：

(1)数据预处理：将¹H NMR自由感应衰减信号导入到Chenomx NMR suit软件中，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，以DSS-d₆峰作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形，根据¹H NMR谱图中信号的相关信息，以DSS-d₆峰的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对24张样本谱图的信号逐一比对分析，然后把代谢物和对应的绝对值浓度导出到EXCEL表格中，即得到了一个代谢物变量矩阵；

(2)化学计量学分析：将所述变量矩阵作为源数据进行后续的主成分分析和偏最小二乘法-判别分析，通过组间代谢物的比较分析，从复杂数据中判别出差异积累的代谢物；

对粗枝云杉干化前后体胚的子叶和胚根分开进行检测和分析，通过对干化前后子叶和胚根的代谢物差异分析，筛选到精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸可作为判断粗枝云杉体胚萌发能力强弱的标记代谢物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NMR检测的具体参数条件为：

3.NMR技术在筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物中的应用，其特征在于，所述标记代谢物为精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸。

4.精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸在作为粗枝云杉体胚萌发标记代谢物中的应用。